李西蒙，康 媛，張小雨，齊睿娟，蔡潤蘭，高 源，齊 云

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

活性氧分子是一類生物有氧代謝的產(chǎn)物，帶未成對電子，性質(zhì)活潑，可攻擊體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等重要分子[1]。它包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基以及一氧化氮等，其中羥自由基性質(zhì)最活潑也最具攻擊性。當細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等受到羥自由基攻擊后會引發(fā)氧化損傷[2]，進而直接或間接導(dǎo)致多種病理改變，如動脈粥樣硬化、腦缺血、呼吸窘迫綜合征等病癥均有過量的羥自由基參與[3]。因此，尋找具有清除羥自由基作用的藥物具有積極的臨床意義[4]。

芬頓(Fenton)反應(yīng)是通過H2O2與Fe2+相互作用生成羥自由基的經(jīng)典反應(yīng)。受限于Fe2+的溶解性，最初的Fenton反應(yīng)只能在酸性條件下發(fā)生，后來引入螯合劑EDTA與Fe2+形成絡(luò)合物增加了Fe2+的溶解度，使Fenton反應(yīng)得以在生理條件下發(fā)生[5]。這一優(yōu)化促使體外Fenton反應(yīng)與體內(nèi)產(chǎn)生羥自由基的反應(yīng)[6]更為接近而被廣泛采用。因羥自由基極為活潑且在體系中獨立存在的時間太短，清除羥自由基體外實驗往往通過羥自由基與攻擊物反應(yīng)完成后的終產(chǎn)物來間接判斷受試物清除羥自由基的能力，迄今已建立多種檢測方法如可見光法[7]、熒光法[8]、化學(xué)發(fā)光法[9]、高效液相色譜法[10]、電子自旋捕集法[5]等。

盡管可見光法準確且易于推廣，但存在靈敏度不高，受藥物顏色干擾的問題。例如，我們發(fā)現(xiàn)具有清除羥自由基作用的丹參酮I[11]若采用脫氧核糖為捕捉劑、終產(chǎn)物為丙二醛(malondialdehyde，MDA)的可見光法[7]，根本無法展現(xiàn)其作用，甚至因顏色干擾會得出相反的結(jié)論。為此，我們根據(jù)MDA衍生物同時也具有熒光的特點[12]，建立了與此可見光法反應(yīng)原理完全相同的熒光測定法。新方法不僅提高了測定的靈敏度，還避免了受試物顏色及有機溶劑帶來的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1藥物及試劑 二甲基亞砜(DMSO，CAS#67-68-5，LOT#F508BA0021，Purity ≥99.7%)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；丹參酮I(tanshinone I，CAS#568-73-0，LOT#HT034212198，Purity 98%)購自寶雞市辰光生物有限公司；2-脫氧-D-核糖(CAS#533-67-5)購自美國Sigma公司；六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O，CAS#10025-77-1)購自廣東臺山化工廠；EDTA(CAS#60-00-4)購自上海試劑一廠；30%過氧化氫溶液(30% H2O2, CAS#7722-84-1)購自西隴化工股份有限公司；L-抗壞血酸(Vitamin C，VC，CAS#50-81-7)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2-硫代巴比妥酸(TBA，CAS#504-17-6)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT，CAS#128-37-0)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸(TCA，CAS#76-03-9)購自北京市興津化工廠；1,1,3,3-四乙基氧丙烷(TEP CAS#122-31-6)購自美國Fluka公司。

1.1.2主要儀器 熒光/可見光多功能酶標儀(SPARK型，瑞士Tecan公司)；單道移液器(德國Eppendorf公司)；千分之一電子精密天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；十萬分之一電子精密天平(BT125D型，德國Satorius公司)；恒溫水浴鍋(OSB-2100型，上海愛朗儀器有限公司)；低速自動平衡離心機(LDZ5-2型，北京京立離心機有限公司)。

1.1.3主要材料 具塞玻璃試管；Costar 96孔透明酶標板；Costar 96孔全黑酶標板(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1基于終產(chǎn)物MDA的體外羥自由基清除熒光方法的建立 在Halliwell等[7]研究基礎(chǔ)上考察反應(yīng)條件及改變測定方法以建立新方法，具體步驟如下：在試管中依次加入50 μL 2 mmol·L-1的EDTA溶液，50 μL 2 mmol·L-1的FeCl3溶液，50 μL 20 mmol·L-1的H2O2溶液，180 μL適量濃度的脫氧核糖溶液，455 μL受試物，165 μL 100 mmol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液和50 μL 2 mmol·L-1的VC溶液，渦旋混勻。水浴一定時間后加入100 mg·mL-1的TCA溶液、5 g·L-1的 TBA溶液各1 mL及12 g·L-1的BHT乙醇溶液10 μL。沸水浴30 min后加入2 mL正丁醇渦旋萃取，于3 000 r·min-1離心10 min。每管吸取200 μL上清在多功能酶標儀λEx515 nm，λEm553 nm處測定熒光強度[12]。選用丹參酮I作為陽性藥物[11]，以評價所用測定方法的優(yōu)劣。

1.2.2新方法反應(yīng)時間的考察 步驟基本同“1.2.1”，變動如下：在脫氧核糖終濃度2.8 mmol·L-1條件下，反應(yīng)時間選取為37 ℃下分別水浴0、15、30、60、90 min。

1.2.3新方法羥自由基生成溫度的考察 步驟基本同“1.2.1”，變動如下：在脫氧核糖終濃度2.8 mmol·L-1條件下，選取羥自由基生成溫度0 ℃、24 ℃、37 ℃并在“1.2.2”考察所得的適宜反應(yīng)時間下進行。

1.2.4新方法關(guān)鍵反應(yīng)物脫氧核糖濃度的考察 步驟基本同“1.2.1”，變動如下：選取脫氧核糖濃度分別為0.35、0.7、1.4、2.8、5.6 mmol·L-1，并在“1.2.2”及“1.2.3”考察所得的適宜反應(yīng)條件下進行。

1.2.5基于終產(chǎn)物MDA的可見光法 反應(yīng)步驟同“1.2.1”。反應(yīng)完成后每管吸取200 μL上清在多功能酶標儀波長532 nm處測定吸光度[12]。

2 結(jié)果

2.1 基于終產(chǎn)物MDA的體外羥自由基清除熒光方法的建立

2.1.1反應(yīng)時間考察 在37 ℃條件下, 未加入關(guān)鍵反應(yīng)物脫氧核糖的反應(yīng)體系(反應(yīng)未啟動)熒光值幾乎可忽略不計(Fig 1:-15 min點)；當加入本身亦無熒光的脫氧核糖啟動反應(yīng)后立刻測定(以Fig 1的0點表示)，相對熒光強度可達22 000,表明Fenton反應(yīng)極為快速。在隨后的90 min內(nèi)反應(yīng)仍在繼續(xù)進行，但60 min后反應(yīng)趨于緩慢。故后續(xù)實驗擬選擇60 min為反應(yīng)時間。

Fig 1 Time-course of formation of hydroxyl radicals

2.1.2羥自由基生成溫度考察 不同于一般的酶反應(yīng)，F(xiàn)enton反應(yīng)是普通的化學(xué)反應(yīng)，我們接下來考察了溫度對其反應(yīng)的影響。從Fig 2可見，在60 min反應(yīng)時間內(nèi)，即使在0 ℃條件下，F(xiàn)enton反應(yīng)仍可正常發(fā)生，但近生理溫度37 ℃條件下的反應(yīng)較之于0 ℃或24 ℃更為充分。因此，選擇接近生理溫度的37 ℃作后續(xù)實驗的反應(yīng)溫度。

Fig 2 Effect of temperature on formation of

2.1.3脫氧核糖濃度考察 羥自由基是極為活潑的，難以直接測定。作為羥自由基捕捉劑，脫氧核糖是最關(guān)鍵反應(yīng)物，確保其有飽和量去捕捉羥自由基是至關(guān)重要的。本研究選取了0.35、0.7、1.4、2.8、5.6 mmol·L-1的脫氧核糖終濃度進行考察。結(jié)果如Fig 3所示，隨著脫氧核糖終濃度升高，熒光測定值逐漸增大，在2.8～5.6 mmol·L-1濃度范圍內(nèi)，測定值幾乎到達平臺，表明此時的脫氧核糖濃度對于反應(yīng)體系來說已經(jīng)飽和。故以終濃度2.8 mmol·L-1作為脫氧核糖的足量反應(yīng)濃度。

Fig 3 Effect of concentration of deoxyribose on formation of hydroxyl radicals

2.2 熒光法與可見光法的靈敏度比較以TEP(其水解產(chǎn)物即為MDA)作為標準品，制作兩種方法的標準曲線。結(jié)果如Fig 4所示，在TEP終濃度0.25～6.25 μmol·L-1范圍內(nèi)，熒光法測定值呈線性關(guān)系(R2=0.992 6)；在TEP終濃度4～32 μmol·L-1范圍內(nèi)，可見光法測定值亦呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 3)。我們根據(jù)信噪比3 ∶1計算最低檢測限來比較兩法的靈敏度。結(jié)果顯示，熒光法的最低檢測限為4.49 nmol·L-1(Fig 4A)，而可見光法的最低檢測限為39.15 nmol· L-1(Fig 4B)。顯然，熒光法的最低檢測限要遠低于可見光法，靈敏度也更高。

Fig 4 Comparison of sensitivity of two methods, fluorescence method and visible spectrophotometry

2.3 熒光法與可見光法在不同溶劑體系下的比較根據(jù)受試物配制情況的不同，我們考察了兩種方法在水系(不含有機溶劑)和有機系(含終濃度1% DMSO)中的差異。如Fig 5所示，在水系中，可見光法測定反應(yīng)孔(模型孔)的吸光度值是未反應(yīng)孔的16倍；而熒光法測定所得比值可高達159倍。在含DMSO的有機系中，可見光法的反應(yīng)孔與未反應(yīng)孔的比值從原有16倍降為1.4倍，且OD值<0.2；雖然熒光法的測定比值也從原有的近160倍降為45倍，但45倍的測定窗仍足以正常評估脂溶性受試物清除羥自由基的能力。

2.4 兩種方法考察丹參酮I清除羥自由基能力本實驗選擇棕紅色、脂溶性、可清除羥自由基的丹參酮I[11]來進行兩種方法的對比。首先考察了不同濃度丹參酮I在532 nm處的吸光度值，以及在λEx515 nm/λEm553 nm處的相對熒光值。從Fig 6可見，丹參酮I不具有熒光特性(Fig 6A)，但由于其自身的顏色，在532 nm處有明顯的吸光度值(Fig 6B)。相應(yīng)地，在熒光法中，丹參酮I在終濃度62.5～1 000 mg·L-1范圍內(nèi)的清除羥自由基能力呈濃度依賴的增強(Fig 6C)；而可見光法(Fig 6D)不僅不能體現(xiàn)本應(yīng)有的清除羥自由基的作用，反而吸光度值隨著藥物濃度的增大而增加，這應(yīng)該是其自身顏色嚴重干擾及檢測窗口被大幅度壓縮造成的。

3 討論

Fenton反應(yīng)是一個生成羥自由基的經(jīng)典反應(yīng)，不僅在環(huán)境化學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，而且還是細胞鐵死亡(一種鐵離子依賴的獨特的程序性細胞死亡方式)的重要反應(yīng)機制[13]。

由于羥自由基的極不穩(wěn)定性，故清除羥自由基的體外實驗往往通過測定羥自由基與其捕捉劑所生成的穩(wěn)定終產(chǎn)物來間接判斷。目前應(yīng)用最廣的捕捉劑是脫氧核糖(終產(chǎn)物為MDA)、水楊酸(終產(chǎn)物是2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸)或鄰二氮菲(終產(chǎn)物是鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物)，而最終檢測的手段均是可見光法。我們的研究發(fā)現(xiàn)，基于MDA的可見光法(檢測波長為532 nm)受藥物顏色干擾嚴重，無法評價在該波長附近有干擾的受試物的作用(Fig 6B，D)。而水楊酸法和鄰二氮菲法的測定波長均為510 nm[14]，與532 nm十分接近，故也存在同樣的局限性。結(jié)合本課題組之前的研究[12]，我們利用原可見光法所測定的發(fā)色物質(zhì)MDA-TBA加合物(三甲川)同時也具有熒光的特性(λEx515 nm/λEm553 nm)建立了熒光法。我們首先考察了熒光測定法的最佳條件，包括反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及羥自由基捕捉劑脫氧核糖的濃度，并對比了新舊兩法。結(jié)果顯示，相較于可見光法，熒光法不僅能大幅度提高檢測的靈敏度(最低檢測限為4.49 nmol·L-1, Fig 4A)及擴大測定窗口(Fig 5)，還可有效避開有色藥物對檢測體系嚴重干擾(Fig 6A, C)。

除了受藥物顏色干擾之外，可見光法對有機試劑的耐受度也極差。作為脂溶性藥物的常用溶劑，DMSO本身就具有一定的羥自由基清除能力[15]。我們的研究結(jié)果顯示(Fig 5)，體系中僅存的1%DMSO就能將可見光法的測定窗口幾乎壓平，從而失去了評價受試物所需的“清除”空間；而熒光法盡管也受DMSO干擾較大，但其測定窗口寬，所以仍有足夠的“清除”空間可供評價受試物的清除能力。事實上，不止是DMSO，包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、DMF在內(nèi)的一系列有機溶劑自身均具有清除羥自由基的能力[15]，存在與DMSO相同的問題。在本研究中，我們刻意選擇了一個采用電子順磁共振自旋俘獲法已確證的具有羥自由基清除能力的棕紅色脂溶性化合物丹參酮I[11]作為受試物進行了可見光法和熒光法的對比測定。結(jié)果顯示，可見光法不僅無法體現(xiàn)其清除羥自由基的作用，反而因藥物本身的顏色干擾呈現(xiàn)出了相反的效果(Fig 6B，D)；而熒光法則能劑量依賴性地展現(xiàn)出丹參酮I清除羥自由基的作用(Fig 6C)，與文獻報道[11]一致。由此可見，可見光法僅適用于考察水溶性無色受試物清除羥自由基的能力，而熒光法不僅不受藥物顏色干擾(在λEx515 nm/λEm553 nm處自身具有熒光的受試物除外)，還可應(yīng)用于水不溶性藥物的作用評價。

綜上，本研究成功建立了基于終產(chǎn)物MDA的羥自由基熒光檢測方法。相較于可見光法，熒光法具有靈敏度高、測定窗口寬、受測試物顏色干擾小及對有機溶劑耐受度好這四大優(yōu)勢。這一方法的建立可極大程度地彌補原有可見光法在方法學(xué)上存在的局限性。