玉蘇甫·馬合木提，阿布都熱合曼·阿卜拉，蘇日青，卡合爾曼·卡德爾，成金亮，麥麥提亞生·麥麥提吐爾遜，姜世豪，買買提力·艾沙，汪永新，成曉江

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊 830054)

腦卒中是由向大腦傳送血液的血管系統(tǒng)引起的急性疾病，是世界三大疾病相關死因之一，腦卒中分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占所有腦卒中患者的87%[1]。目前公認盡早恢復缺血區(qū)域血流是治療腦缺血最有效的治療方法，只有在缺血性卒中發(fā)作后4.5 h內(nèi)使用阿替普酶(Alteplase)靜脈溶栓或發(fā)作后6-24 h進行血管內(nèi)取栓術和動脈內(nèi)溶栓治療是有效的，然而，缺血區(qū)域恢復血供甚至會進一步加劇腦缺血引起的腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemic reperfusion injury, CIRI)[2-3]。CIRI的發(fā)生發(fā)展機制較為復雜，據(jù)報道有多種病理生理參與了該過程，包括氧化應激、自噬、細胞凋亡、炎癥和細胞壞死等，自噬在CIRI過程中發(fā)揮重要作用[4]。因此，自噬與CIRI機制的深刻研究可能為CIRI的診治提供新靶點。

自噬作為重要的病理生理過程，在正常條件下會有規(guī)律的進行，并且自噬對于大腦的細胞穩(wěn)態(tài)至關重要。在遇到應急(如營養(yǎng)缺乏、饑餓)或急性損傷的條件下(如創(chuàng)傷、缺血/再灌注等)自噬會增加，并且增加量可能與應激/損傷程度成正比；據(jù)報道，在各種類型的急性腦損傷后，包括外傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)、腦卒中和癲癇發(fā)作，自噬會相應的增加，各種實驗模型報道一部分有促進自噬，有部分會抑制自噬，大腦中這種自噬的增減是否代表了一種保護反應、病理過程或一種偶發(fā)的現(xiàn)象仍存在爭議[5]。因此，自噬在CIRI中是一把雙刃劍。

18 ku轉(zhuǎn)位蛋白(18 ku translocator protein，TSPO)定位于細胞線粒體上的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，是外周苯二氮受體(benzodiazepine receptor，PBR)，它能夠結合中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system, CNS)外的苯二氮類藥物，在癌癥、炎癥、機械損傷和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等各種病理條件下均容易在小膠質(zhì)細胞中上調(diào)[6]。研究表明，TSPO可作為靶點限制神經(jīng)炎癥和繼發(fā)性腦損傷[7]。近期研究顯示，TSPO在神經(jīng)腫瘤增殖、自噬進展中發(fā)揮重要作用，但目前尚未見TSPO在腦缺血/再灌注損傷與自噬相關的研究。因此，本實驗通過體外對BV2小膠質(zhì)細胞采用氧糖剝奪/復糖復氧模型(oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)模擬CIRI模型，初步研究TSPO對CIRI的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 細胞BV-2細胞(小鼠小膠質(zhì)細胞)，購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑MEM培養(yǎng)基(32571-036)購于GIBCO公司；胎牛血清(FND500)購于ExcellBio公司；胰蛋白酶(25200-056)、雙抗(15070-063)均購于GIBCO公司；PBS(ZLI-9062)購于北京中杉金橋生物公司；TSPO三保一慢病毒(LV-TSPO-RNAi)載體構建以及陰性對照病毒NCshRNA和TSPOshRNA委托上海吉凱基因公司完成；TSPO抗體(ab92291)；p62(ab109012)、LC3B(ab192890)、Beclin-1(ab207612)、β-actin(ab92291)等抗體均購于美國Abcam公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒、細胞毒性檢測試劑盒(FC101-03)購于北京全式金生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器細胞超凈臺(HF1200LC)，臺式低速離心機(DK-80)，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(SmartCell HF-90)，三氣培養(yǎng)箱(HF100)均購于上海力康儀器有限公司，熒光酶標儀(VLB000D2)，高速冷凍離心機(Heraeus Multifuge X1R)均購于賽默飛世爾科技公司；電泳儀(DYCZ-24DN)購于北京六一生物科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)(2500)購于上海天能科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1細胞培養(yǎng)與細胞分組

1.4.1.1 實驗分組 首先將BV-2小膠質(zhì)細胞分為正常組(control)、模型組(OGD/R)，通過觀察兩組細胞生存情況和乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase, LDH)含量明確最佳缺氧復養(yǎng)時間；為進一步觀察TSPO在OGD/R中對BV-2小膠質(zhì)細胞損傷的作用，我們采取TSPO短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)抑制TSPO表達，分別以TSPOshRNA空載病毒組、NCshRNA陰性對照作為空白對照組；將BV-2小膠質(zhì)細胞分為4組：正常組(control)、氧糖剝奪/復糖復氧組(OGD/R)、shRNA陰性對照組(OGD/R+NCshRNA)、TSPO短發(fā)夾RNA組(OGD/R+TSPOshRNA)。

1.4.1.2 細胞復蘇、培養(yǎng)與傳代 液氮取出的BV2小膠質(zhì)細胞，37 ℃水浴快速復蘇后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，1%雙抗(抗青霉素/鏈霉素)培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細胞，BV2置于5%CO2、37 ℃適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待細胞生長值密度為90%左右時進行傳代培養(yǎng)。

1.4.1.3 建立OGD/R模型 BV2細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，細胞長至60%后，用PBS沖洗，再加入不含血清的MEM培養(yǎng)基，在置入95%N2+5%O2的37 ℃飽和三氣培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)3、6、12 h。缺氧不同時間后，更換新鮮的MEM完全培養(yǎng)基，置入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h。對照組在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應時間，選擇缺氧6 h為OGD干預時間。除正常組以外，其他三組均需要氧糖剝奪6 h，復糖復氧18 h建立OGD/R模型。

1.4.1.4 細胞轉(zhuǎn)染以及沉默TSPO穩(wěn)定慢病毒表達株的構建 陰性對照病毒(LV-EGFP-NC)感染在培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞融合度為30%小膠質(zhì)細胞，用無血清培養(yǎng)基依次將病毒稀釋至滴度1×1011TU·L-1，1×1010TU·L-1，1×109TU·L-1，更換培養(yǎng)基加入病毒及相應感染增強液，感染12 h后換回正常培養(yǎng)基。感染約72 h熒光表達豐度較高時，用顯微鏡觀察。感染效率80%左右，且細胞生長良好的組所對應的感染條件和MOI即可作為后續(xù)感染實驗的依據(jù)。按上述感染條件使用三種LV-TSPO-RNAi感染細胞，采用qRT-qPCR篩選最佳TSPO沉默慢病毒，通過Western blot檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.4.2CCK-8法檢測細胞增殖 將BV2細胞接種至96孔板中，按實驗分組干預；干預完成后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL配置好的10% CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標儀測定450 nm處的光密度(optical density, OD)值。

1.4.3ROS細胞毒性檢測 取生長狀態(tài)良好匯合率達90%的BV2細胞，胰酶消化細胞后，用完全培養(yǎng)基制備成1×108L-1單細胞懸液，接種至6孔板中(2 mL每孔，2×105每孔)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 長至80%后，按實驗分組進行細胞干預。干預完成后，每孔加入2 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)與2 μL DCFH-DA稀釋液，DCFH-DA終濃度為10 μmol·L-1。置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育30 min，收集細胞，PBS洗滌2次，用PBS重懸細胞至1×109L-1，取100 μL細胞懸液加到96孔不透光白色板中，用熒光酶標儀上機檢測熒光強度值。熒光檢測波長設置：激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.4.4qRT-PCR檢測細胞中各類mRNA的表達 細胞接種于96孔板中培養(yǎng)，按實驗分組進行細胞干預完成后，棄去培養(yǎng)基，使用PBS緩沖液溫柔清洗后，加入1 mL TRIzol提取細胞總RNA，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟得到cDNA，以小鼠源β-actin作為內(nèi)參，采用qRT-RCR檢測相關指標mRNA的相對表達量。小鼠源TSPO引物序列：前引物：5′- GCCTACTTTGTACGTGGCGAG-3′；后引物：5′- CCTCCCAGCTCTTTCCAGAC-3′。

1.4.5Western blot檢測細胞各類蛋白表達 各組細胞按實驗分組進行細胞干預完成后，棄去培養(yǎng)基，加入3 mL無菌的PBS緩沖液反復沖洗2遍，棄去PBS緩沖液，用胰酶消化細胞，操作方法同細胞傳代。離心后棄去上清液留細胞沉淀，用5 mL無菌PBS洗一遍后收集細胞。加入RIPA ∶PMSF ∶廣譜磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1，玻璃勻漿器冰上充分勻漿，冰浴放置60 min后，12 000 r·min-1，4 ℃，離心15 min收集上清。取上清用BCA試劑盒測量蛋白濃度。用凝膠電泳法分離各蛋白，再轉(zhuǎn)膜后，使用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉含有蛋白的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)轉(zhuǎn)運膜1 h。加入TSPO(1 ∶800)、LC3B(1 ∶1 000)、p62(1 ∶800)、Beclin-1(1 ∶1 500)、β-actin(1 ∶1 000)一抗4 ℃過夜，TBST緩沖液漂洗3次(5min/次)，加入適當稀釋的二抗山羊抗小鼠IgG H&L (HRP) (1 ∶15 000)，HRP-兔抗山羊IgG、山羊抗兔IgG H&L (HRP)(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，5 min/次，將顯色液A液和B液混合，加2 mL至膜上，用ChemiScope mini化學發(fā)光儀檢測，拍照，β-actin作為內(nèi)參。

2 結果

2.1 TSPO在BV2細胞OGD/R損傷模型中明顯上調(diào)通過Western blot、qRT-PCR檢測TSPO在BV2細胞OGD/R損傷模型中的變化(Fig 1A、1B、1C)。與Control組比較，氧糖剝奪6 h，復糖復氧18 h后，TSPO蛋白和TSPO mRNA的表達含量明顯上調(diào)，并且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；OGD/R組與OGD/R+NCshRNA組之間TSPO蛋白和TSPO mRNA的表達含量差異無統(tǒng)計學意義；與OGD/R+NCshRNA組比較，OGD/R+TSPOshRNA組中TSPO蛋白和TSPO mRNA的表達含量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 TSPO抑制對OGD/R小膠質(zhì)細胞增殖的影響CCK-8細胞增殖檢測結果提示(Fig 2A)，與Control組比較，OGD/R組小膠質(zhì)細胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，OGD/R+NCshRNA組小膠質(zhì)細胞存活率無差異；而OGD/R+TSPOshRNA組與OGD/R+NCshRNA組比較，TSPO抑制組中小膠質(zhì)細胞存活率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 2 Effect of TSPO on cell viability and cytotoxicity n=3)

2.3 TSPO抑制對OGD/R小膠質(zhì)細胞內(nèi)ROS水平的影響小膠質(zhì)細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen stress，ROS)水平檢測提示(Fig 2B)，與Control組比較，OGD/R組小膠質(zhì)細胞內(nèi)ROS水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與OGD/R組比較，OGD/R + NCshRNA組小膠質(zhì)細胞內(nèi)ROS水平升高，結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與OGD/R + NCshRNA組比較，OGD/R+TSPOshRNA組小膠質(zhì)細胞內(nèi)ROS水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 TSPO抑制對OGD/R處理的BV2細胞自噬水平mRNA的影響通過qRT-PCR實驗檢測BV2小膠質(zhì)細胞中自噬相關LC3B mRNA、Beclin-1 mRNA以及p62 mRNA的表達改變(Fig 3C)。OGD/R后，與Control組比較，OGD/R組小膠質(zhì)細胞中p62 mRNA表達減少、LC3B mRNA和Beclin-1 mRNA表達明顯增加，細胞自噬被激活，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；OGD/R組與OGD/R+NCshRNA組之間各自噬水平相關mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義；與OGD/R+NCshRNA組比較，OGD/R+TSPOshRNA組小膠質(zhì)細胞內(nèi)p62 mRNA表達明顯增加，LC3B mRNA和Beclin-1 mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明，下調(diào)TSPO后，細胞自噬水平被抑制。

Fig 3 Effect of TSPO down-regulation on autophagy in OGD/R-treated BV2 cells n=3)

2.5 TSPO抑制對OGD/R處理的BV2細胞自噬水平蛋白的影響為探討TSPO抑制在OGD/R后小膠質(zhì)細胞損傷的機制，采用Western blot實驗檢測自噬水平相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1以及p62的表達情況。結果見Fig 3A、3B所示，OGD/R后，與Control組比較，OGD/R組小膠質(zhì)細胞中p62蛋白表達減少、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達明顯增加，細胞自噬被激活，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與OGD/R組對比，OGD/R+NCshRNA組小膠質(zhì)細胞中各個自噬水平蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與OGD/R+NCshRNA組對比，OGD/R+TSPOshRNA組小膠質(zhì)細胞中p62蛋白表達增加、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白和Beclin-1蛋白表達明顯降低，細胞自噬被抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

適當?shù)淖允蓪θ毖纳窠?jīng)組織有保護作用，而過度的自噬可能導致細胞死亡，炎癥反應對缺血后神經(jīng)細胞的存活和神經(jīng)組織的恢復起著重要作用，在缺血性卒中的發(fā)病機制中，自噬和炎癥之間存在相互作用[4]。自噬的重要作用不僅體現(xiàn)在如細胞生長、分化和衰老等生理過程，而且也伴隨著一些病理條件發(fā)揮重要作用，例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、心腦血管病等[8]。目前的證據(jù)表明，自噬在腦缺血損傷后神經(jīng)保護中有雙重作用；一方面，3 methyladenine (3-MA)和wortmannin (WM)抑制自噬通路的激活，促進新生大鼠神經(jīng)元凋亡和壞死，增加缺血缺氧所致的腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損;相反，在缺血缺氧前使用雷帕霉素激活自噬通路可增加Akt和cAMP反應元件結合蛋白CREB的磷酸化，從而顯著減少神經(jīng)元死亡和腦損傷[9]。另一方面，體外和體內(nèi)研究也表明，細胞過度自噬也會導致神經(jīng)元死亡(自噬細胞死亡)[10]。因此，自噬在腦缺血中的作用可能取決于其作用的時間或激活/抑制的程度。

TSPO的表達在神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)炎癥和精神疾病中發(fā)生改變[11]。Gatliff等[12]研究表明，TSPO通過與線粒體電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC1)結合，減少線粒體偶聯(lián)，并促進ROS的過量產(chǎn)生，從而抵消了蛋白質(zhì)泛素化，表明TSPO是通過自噬來調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量的一個重要因素。在一項大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)動物實驗中發(fā)現(xiàn)，TSPO蛋白和mRNA的表達量明顯增加，并且促進了炎癥反應，在使用相同方法，缺血更長時間檢測到較強的TSPO+CD11b+，表明TSPO是主要表達在小膠質(zhì)細胞中。小膠質(zhì)細胞已被證明與中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的發(fā)展和維持有關，但在神經(jīng)組織損傷時，小膠質(zhì)細胞被激活并促進神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性變[13]。Nozaki等[14]發(fā)現(xiàn)，通過LPS刺激培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞中TSPO的表達量明顯增多，并且伴隨著細胞炎癥因子和ROS的升高。這表明TSPO可能通過介導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生ROS和細胞因子從而加重損傷。Lan等[15]研究表明，TSPO的拮抗劑pk11195通過抑制小膠質(zhì)細胞的活化和自噬來緩解脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的大鼠認知功能障礙。我們研究了TSPO調(diào)節(jié)CIRI中的潛在的機制，研究表明，在OGD/R損傷的BV2細胞中，自噬被激活，并伴有TSPO上調(diào)，細胞增殖能力降低，細胞毒性增加。自噬作為能量和細胞穩(wěn)態(tài)的重要降解途徑，主要是作為一種防御機制，可能在應激環(huán)境下防止細胞死亡。同時，自噬在腦I/R損傷中有促生存或促死亡的作用，被認為是一把雙刃劍。在OGD/R條件下，TSPO表達升高明顯促進了BV2細胞中LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化和Beclin1水平，p62表達水平明顯降低，說明TSPO表達增加促進自噬激活；而OGD/R+TSPOshRNA組中自噬活動被抑制。由此我們推斷，抑制TSPO表達可降低小膠質(zhì)細胞在OGD/R中的自噬激活，減輕神經(jīng)細胞損傷，從而促進神經(jīng)保護作用。

在各種損傷和疾病的實驗模型中，TSPO配體已被證明可以抑制小膠質(zhì)細胞的激活，提高神經(jīng)元的存活率，并改善再生過程[16]。已知TSPO主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞，靜息狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞中TSPO的表達較低，但當小膠質(zhì)細胞被激活時，其表達顯著增加[17]。本研究通過shRNA抑制TSPO在小膠質(zhì)細胞中的表達，并進行OGD/R處理，觀察小膠質(zhì)細胞的活力及損傷情況。CCK-8細胞增殖檢測顯示，OGD/R組細胞活力明顯降低，OGD/R+TSPOshRNA組細胞活力與Control組無差異；細胞ROS檢測表明，OGD/R處理細胞ROS含量明顯增高，OGD/R+TSPOshRNA組ROS含量比OGD/R組低。由此可得，OGD/R對小膠質(zhì)細胞有損傷作用，而TSPO抑制的OGD/R細胞中，細胞活力增加，細胞損傷程度降低，推測TSPO抑制對小膠質(zhì)細胞具有保護作用，并且這保護作用可以通過抑制細胞自噬實現(xiàn)。

綜上，抑制TSPO對OGD/R誘導的BV2小膠質(zhì)細胞損傷有顯著的保護作用，其細胞損傷機制可能與OGD/R上調(diào)TSPO，進一步促進自噬激活相關。TSPO有望成為干預CIRI的新靶點。但TSPO對OGD/R小膠質(zhì)細胞損傷相關的自噬途徑和可能的作用機制尚不明確，需進一步實驗驗證。