秦曉玥，李穗敏，曾 鵬，陳淑貞，王義蓉，鄺素娟，楊 慧，饒 芳,鄧春玉

[1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)醫(yī)學研究部臨床藥理重點實驗室，廣東 廣州 510080；3.華南理工大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510006; 4.廣東省心血管病研究所心血管內科，廣東 廣州 510080]

正常血管平滑肌細胞(VSMCs)通過細胞內外鈣的交換和細胞內鈣庫的調節(jié)兩種方式來調節(jié)細胞內Ca2+濃度。細胞膜主要通過L型鈣通道等電壓操縱性鈣通道，鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channels，SOC)和受體操縱的鈣通道控制細胞內外Ca2+交換[1]。胞內Ca2+是VSMCs重要的第二信使，參與VSMCs“興奮-收縮偶聯(lián)”與“興奮-轉錄偶聯(lián)”過程，首先發(fā)揮“興奮-收縮偶聯(lián)”功能調節(jié)。常用的血管平滑肌收縮劑苯腎上腺素(phenyhrine，Phe)和5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)分別與VSMCs膜上α、5-HT2A受體結合，通過與Gq蛋白結合而激活磷脂C(PLC)，使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)水解為三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)，IP3與內質網上IP3受體結合誘導內質網Ca2+流入細胞質中。同時，內質網中的Ca2+耗竭，誘導SOC通道開放，細胞外Ca2+內流，稱為鈣庫操縱性鈣內流(store-operated calcium entry, SOCE)[2]。此外，DAG還可以激活不依賴于肌漿網鈣釋放的花生四烯酸調控的鈣通道(arachidonate-regulated Ca2+，ARC)來增加細胞內鈣濃度[3]。

SOC通道是廣泛存在于興奮性和非興奮性細胞中介導Ca2+進入細胞內的重要通道，研究表明，許多疾病都與SOC異常有關，如SOCE的異?？稍黾友“宓酿じ叫圆⒕奂?，這可導致糖尿病的微血管和大血管病變的發(fā)生[4]；腎系膜細胞中SOC功能的下調，可抗腎臟纖維化等[5]。但是，腎內動脈平滑肌細胞SOC通道的激活機制還需進一步研究。已有報道SOC通道激活與鈣非依賴性磷脂酶A2(calcium-independent phospholipase A2，iPLA2)密切相關，有效的iPLA2不可逆抑制劑BEL可減少主動脈平滑肌細胞的SOC通道介導鈣內流，抑制細胞增殖[6]。磷脂酶A2(PLA2)是一類水解磷脂酯鍵的酶，分解產生花生四烯酸(arachidonic acid，AA)和溶血磷脂等，iPLA2主要與膜相關，且已在心臟、小動脈內皮細胞和腎臟中報道了內質網相關iPLA2活性[7]。已有報道提出，PLA2除了可以調控SOC通道外，分解產生的微量AA還可以激活ARC通道[8]。然而，iPLA2在腎內動脈平滑肌鈣調控中的作用，有待進一步闡明。本研究通過觀察BEL對腎內動脈血管張力的影響，探討iPLA2與腎內動脈平滑肌鈣調控的關系。

1 材料

1.1 實驗動物18周齡SPF級C57BL/6小鼠，雄性，共30只，購于廣東斯嘉景達生物科技有限公司，許可證號：SCXK(粵)2020-0052，飼養(yǎng)于華南理工大學實驗動物中心。本研究所有動物實驗已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)的動物實驗倫理審查(NoGDRE201208a)。

1.2 實驗藥物5-HT(091M5163V)、Phe(039K1453)、硝苯地平(nifedipine,57H1139)、毒胡蘿卜素(TG,049M4032V)、EGTA(111K5411)均購于Sigma公司；Fluo-4AM(2298173)購于賽默飛公司；AA(HY-109590)、BEL(HY-107411)購于MCE公司；其余試劑皆為國產分析純。

1.3 實驗溶液Krebs Henseleit溶液(K-H溶液)(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、 MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D glucose 11.1；高鉀K-H溶液(mmol·L-1)：KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1；Ca2+-free K-H溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、D-glucose 11.1、EGTA 0.05；Ca2+-free高鉀K-H溶液(mmol·L-1)：KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KH2PO41.2、D-glucose 11.1、EGTA 0.05；含Ca2+臺式液(mmol·L-1)：NaCl 136、MgCl2·6H2O 1、KCl 5.4、NaH2PO4·2H2O 0.33、CaCl2·2H2O 1.0、HEPES 10.0、D glucose 10；張力實驗所用溶液根據(jù)上述濃度配好后均通95% O2±5% CO2混合氣使其充分飽和，臺式液需用NaOH(3 mol·L-1)調至7.40。

1.4 實驗儀器620M型小血管張力測定儀(丹麥，DMT公司)；PowerLab 8/30生物信號采集處理系統(tǒng)(澳大利亞，AD公司)；Stemi DV4型體視顯微鏡(德國，ZEISS公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設備廠)；Leica SP5-FCS激光共聚焦顯微鏡。

2 方法

2.1 小鼠離體腎內動脈血管環(huán)的制備離體腎內動脈血管環(huán)制備同已發(fā)表文獻[9-10]。頸椎脫臼法處死小鼠后，快速取出腎，放入4 ℃預冷并通混合氣的K-H溶液中，借助體視顯微鏡去除腎內動脈血管周圍的其他組織，無損傷的分離出腎內動脈血管，剪成長度為2.0 mm左右的血管環(huán)；用兩根直徑40 μm的不銹鋼絲先后穿過血管環(huán)，將其固定在張力測定儀浴槽內的兩個鉗夾上，在穿入鋼絲的同時輕微摩擦去除內皮，擰緊兩根鋼絲并使其處于平行狀態(tài)保證血管受力均勻。在恒溫37 ℃和持續(xù)通入混合氣的浴槽中固定好血管環(huán)，平衡30 min后，給予腎內動脈1.5 mN的基礎張力，每15 min置換溶液1次，并使基礎張力維持在1.5 mN，平衡60 min后加藥反應。

2.2 血管反應性及內皮完整性測定血管張力反應性檢測同已發(fā)表文獻[9,10]。待血管張力穩(wěn)定后，給予1.5 mN基礎張力，然后高鉀K-H溶液刺激，檢測血管反應性。高鉀溶液刺激達到最大張力后，K-H溶液洗4次，使其恢復至基線，穩(wěn)定15 min后，調整基礎張力，再用高鉀K-H溶液置換K-H溶液，反復操作，直至連續(xù)兩次高鉀溶液刺激引起的血管張力值相差不超過10%，可進行后續(xù)實驗。穩(wěn)定20 min后，加入血管收縮劑Phe(1 μmol·L-1)，血管收縮，待張力達最大值并趨于穩(wěn)定后加入血管舒張劑Ach(1 μmol·L-1)，若血管舒張程度在10%以內，視為內皮去除完全，可進行后續(xù)試驗。

2.3 實驗藥物對離體腎內動脈血管張力變化的影響

2.3.1BEL對血管收縮劑誘導腎內動脈血管收縮反應影響 對血管功能性檢測合格并檢測內皮完整性的血管，采用濃度梯度給藥法，分別加入各濃度梯度的血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和Phe(0.001～10 μmol·L-1)，觀察血管張力的變化。當血管收縮效應達到最大值不再變化后，用K-H液洗脫4次，洗至基線穩(wěn)定后，加入溴烯醇內酯(10 μmol·L-1)孵育30 min，重復上述5-HT和Phe濃度梯度給藥，觀察溴烯醇內酯對血管收縮量效曲線的影響。

2.3.2BEL對L型鈣通道介導腎內動脈血管收縮反應影響 另取血管功能性檢測合格并檢測內皮完整性的血管，Ca2+-free高鉀K-H溶液洗脫至基線平衡，穩(wěn)定20 min加累計濃度CaCl2(0.001～5 mmol·L-1)，當血管收縮反應達到最大值不再變化后，用K-H液洗脫4次，洗至基線穩(wěn)定后，繼續(xù)用Ca2+-free高鉀K-H溶液洗至基線，加溴烯醇內酯(10 μmol·L-1)孵育30 min，重復累計濃度CaCl2，觀察溴烯醇內酯對L型鈣通道影響。

2.3.3BEL對肌漿網鈣釋放介導腎內動脈血管收縮反應影響 另取功能檢測合格并檢測內皮完整性的血管，在Ca2+-free K-H溶液洗脫后，加硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育30 min，5-HT和Phe濃度梯度給藥，當血管收縮反應達到最大值不再變化后，用Ca2+-free K-H溶液洗脫4次，洗至基線穩(wěn)定后，加入硝苯地平(1 μmol·L-1)和溴烯醇內酯(10 μmol·L-1)共同孵育30 min，重復上述5-HT和Phe濃度梯度給藥，觀察溴烯醇內酯對血管收縮量效曲線的影響。

2.3.4BEL對SOC通道介導腎內動脈血管收縮反應影響 另取血管功能性檢測合格并檢測內皮完整性的血管，Phe(1 μmol·L-1)給藥達到最大濃度后，Ca2+-free K-H溶液洗脫至基線平衡，加硝苯地平(1 μmol·L-1)和TG(2 μmol·L-1)孵育30 min，加入CaCl2(2.5 mmol·L-1)，處理組加BEL(10 μmol·L-1)與硝苯地平和TG共同孵育，觀察BEL對SOC的影響。

2.4 激光共聚焦檢測BEL對平滑肌細胞內Ca2+濃度影響將來源于ATCC的人主動脈平滑肌細胞株均勻種在激光共聚焦專皿上，待其密度達80%左右，洗去培養(yǎng)基，PBS反復清洗，再重新給與1 mL培養(yǎng)基。避光下1 mL培養(yǎng)基中加入3 μL Fluo-4 AM(一種自身不發(fā)光，與Ca2+結合后顯熒光的螯合劑)，在暗處恒溫37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min使熒光充分與細胞內Ca2+結合。棄去含熒光染料培養(yǎng)基，臺式液洗滌，加入1 mL含鈣臺式液。加入硝苯地平(1 μmol·L-1)去除L型鈣通道影響，處理組加入BEL(10 μmol·L-1)共同孵育15 min。在激光共聚焦顯微鏡下找到細胞，設置熒光強度記錄模式，掃描6 min，掃描開始后1 min左右加入AA(8 μmol·L-1)，觀察熒光變化情況。無熒光背景設為F0，細胞靜息狀態(tài)時熒光強度設置為F1，加入AA后最大熒光值記為F2，以(F2-F1)/(F1-F0)為縱坐標，時間為橫坐標作圖。

2.5 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)處理同已發(fā)表文獻[9,10]。以最后兩次高鉀K-H溶液刺激張力值的均值為標準值，各藥物達穩(wěn)態(tài)的血管收縮張力值占標準值的百分數(shù)即藥物引起血管收縮的大小。

3 結果

3.1 BEL抑制收縮劑誘導的小鼠腎內動脈血管張力使用累積濃度梯度法加入血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和Phe(0.001～10 μmol·L-1)，5-HT與Phe均可誘導小鼠腎內動脈血管呈濃度依賴性收縮，在達到最大濃度后洗脫至基線，待其穩(wěn)定后加入BEL(10 μmol·L-1)孵育，發(fā)現(xiàn)孵育BEL后的血管收縮劑5-HT和Phe誘導血管張力較對照組下降(P<0.01)。BEL孵育組對5-HT誘導腎內動脈量效曲線的Emax(85.43±13.30，n=12)明顯低于對照組(113.36±11.66，n=12)(P<0.01)，而pEC50在兩組間差異無顯著性(P>0.05)；BEL孵育組對Phe誘導腎內動脈量效曲線的pEC50(6.48±0.18，n=9)低于對照組(6.68±0.19，n=9)(P<0.05)，而Emax在兩組間差異無顯著性(P>0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of BEL on 5-HT and Phe-induced concentration-dependent vasoconstriction of intrarenal arterial rings in mice

3.2 BEL抑制L型鈣通道誘導的小鼠腎內動脈血管張力在Ca2+-free高鉀K-H溶液多次洗至基線平衡后，加入濃度梯度CaCl2(0.001-5 mmol·L-1)，發(fā)現(xiàn)CaCl2誘導血管呈濃度依賴性收縮。在達到最大濃度后洗脫至基線，待其穩(wěn)定后加入BEL(10 μmoL·L-1)孵育，與正常組對比，BEL孵育組對CaCl2誘導腎內動脈血管張力下降(P<0.01)。BEL孵育組對CaCl2誘導腎內動脈量效曲線的pEC50(3.16±0.13，n=6)低于對照組(3.39±0.16，n=7)(P<0.05)，而Emax差異無顯著性(P>0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Effect of BEL on CaCl2 induced concentration-dependent vasoconstriction of intrarenal arteries in mice

3.3 BEL抑制肌漿網鈣釋放誘導的小鼠腎內動脈血管張力在Ca2+-free K-H溶液中加L型鈣通道阻斷劑硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育后，采用濃度梯度法加入血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和Phe(0.001～10 μmol·L-1)，此時肌漿網鈣釋放誘導血管收縮，在達到最大濃度后洗脫至基線，待其穩(wěn)定后加入BEL(10 μmol·L-1)孵育，發(fā)現(xiàn)BEL孵育組與正常組對比，肌漿網鈣釋放誘導的濃度依賴性收縮明顯下降(P<0.01)，BEL孵育組對Phe誘導腎內動脈量效曲線的Emax和pEC50在兩組間差異均無顯著性(P>0.05)；BEL孵育組對5-HT誘導腎內動脈量效曲線的Emax(11.62±9.92，n=6)低于對照組(23.65±7.09，n=7)(P<0.05)，而pEC50在兩組間差異無顯著性(P>0.05)。見Fig 3。

Fig 3 Effects of BEL on 5-HT and Phe-induced sarcoplasmic reticulum calcium release-induced concentration-dependent vasoconstriction of intrarenal arterial rings in mice

3.4 BEL抑制SOC通道誘導的小鼠腎內動脈血管張力在Ca2+-free K-H溶液中加入L型通道阻斷劑硝苯地平(1 μmol·L-1)和誘導鈣庫釋放的TG(2 μmol·L-1)孵育后,再加入CaCl2(2.5 mmol·L-1)，此時SOC通道誘導腎內動脈血管收縮。在相同處理的另一組加BEL(10 μmol·L-1)孵育，與對照組相比，BEL孵育組SOC通道誘導血管收縮反應低于正常組(n=8，P<0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Effect of BEL on SOC channel-induced intrarenal artery vasoconstriction in mice

3.5 BEL抑制ARC通道誘導的鈣內流于含鈣臺式液中，在人主動脈平滑肌細胞株中加L型鈣通道阻斷劑硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察鈣離子熒光強度變化情況，在1 min左右加入AA(8 μmol·L-1)，熒光逐漸增強，細胞內鈣離子濃度上升。相同處理的另一組加BEL(10 μmol·L-1)孵育，發(fā)現(xiàn)BEL孵育后，與正常組相比，AA誘導的鈣離子熒光強度降低(ncontrol=44，nBEL=21，P<0.01)。見Fig 5。

Fig 5 Effect of BEL on calcium influx induced by ARC channels

4 討論

血管收縮劑與細胞膜上的受體結合后，細胞內鈣([Ca2+]i)增加，可與鈣調蛋白結合，激活肌球蛋白輕鏈激酶，使肌球蛋白磷酸化，從而使平滑肌收縮[11]。[Ca2+]i增加的來源：細胞外Ca2+進入和細胞內Ca2+釋放。細胞內Ca2+主要是鈣庫Ca2+釋放，而L型鈣通道，SOC及ARC等通道開放可使細胞外Ca2+內流。雖然大量研究已經表明iPLA2被抑制后[Ca2+]i受到影響，但它的具體作用機制仍未知。

本研究發(fā)現(xiàn)BEL孵育后腎內動脈血管張力顯著降低，這表明BEL抑制血管收縮劑5-HT和Phe引起的腎內動脈血管平滑肌的收縮，已知鹵代烯醇內酯與iPLA2的底物縮醛磷脂有結構相似性，可與iPLA2共價結合并不可逆地抑制它，且對其他PLA2作用微弱，BEL在各種iPLA2報道中使用居多[8]，提示BEL可能通過抑制iPLA2的作用來抑制腎內動脈血管平滑肌收縮，如何抑制鈣通道影響[Ca2+]i增加，接下來進行探討。

在課題組前期實驗中發(fā)現(xiàn)，L型鈣通道是細胞外鈣進入的主要途徑，通過無鈣高鉀K-H溶液處理使血管張力基線平衡后，加入CaCl2，此時參與血管收縮的是L型鈣通道[12]。與對照組相比，BEL孵育組的血管張力稍微降低，這表明BEL對L型鈣通道也有一定的抑制作用。這與其他報道中，BEL可抑制KCl(60 mmol·L-1)誘導主動脈血管環(huán)收縮結果一致，表明iPLA2參與L型鈣通道誘導血管收縮反應[13]。

無鈣K-H溶液中加入硝苯地平阻斷L型鈣通道后，此時為肌漿網鈣釋放引起血管收縮。與對照組相比，BEL孵育后的肌漿網鈣釋放引起的血管張力明顯下降，提示BEL抑制肌漿網鈣釋放的功能，即iPLA2參與肌漿網鈣釋放作用。無鈣溶液中加入硝苯地平阻斷L型鈣通道，同時加入TG誘導鈣庫釋放，此時SOC通道打開，細胞外鈣內流，引起血管收縮。與對照組相比，BEL孵育后，SOC通道誘導的腎內動脈血管收縮反應下降，表示BEL抑制SOC通道，這與文獻報道的結果一致[14]，即iPLA2參與調控SOC通道，但報道顯示鈣庫釋放耗竭可激活iPLA2活性，從而激活SOC通道。我們實驗發(fā)現(xiàn)，在抑制iPLA2的活性后，鈣庫的鈣釋放功能下降，這表明iPLA2也參與調控鈣庫的鈣釋放作用。

由于直接使用AA刺激腎內動脈血管收縮反應微弱，同時課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，雖然不同器官的平滑肌細胞具有不同的特征，但與冠脈平滑肌對Phe無反應的現(xiàn)象相反，Phe可誘導大鼠和小鼠腎內動脈與主動脈平滑肌收縮，后被證實大鼠和小鼠冠狀動脈平滑肌的SOCE不介導血管收縮，在這一點上，我們認為主動脈平滑肌與腎內動脈平滑肌反應具有相似性，故選用人主動脈平滑肌細胞探索ARC通道的作用[15]。在人主動脈平滑肌細胞株中，加入硝苯地平阻斷L型鈣通道作用后，在細胞外含鈣離子條件下加入AA，此時細胞熒光強度增加，表示細胞外鈣進入胞內，此時是AA激活的ARC通道介導細胞外Ca2+內流。在BEL孵育后，細胞的熒光增強，但與未加BEL組對比，其增強幅度明顯減弱，這表明BEL對ARC通道具有抑制作用，即iPLA2參與AA激活的不依賴鈣庫釋放的ARC通道作用。

綜上所述，本研究在腎內動脈平滑肌中較全面地探討了iPLA2對鈣調控作用，包括：SOC通道、L型鈣通道、肌漿網鈣釋放和ARC通道等。發(fā)現(xiàn)iPLA2被抑制后，肌漿網鈣釋放，SOC通道，ARC通道和L型鈣通道的作用均明顯減弱，從而使小鼠腎內動脈平滑肌收縮反應降低。iPLA2的生理作用具有器官和組織特異性，與iPLA2在心臟、小動脈內皮細胞和腎臟中報道的保護細胞免受氧化劑誘導的細胞死亡作用不同[7]，平滑肌中iPLA2與鈣調蛋白相連，在無催化活性狀態(tài)時，它與鈣和鈣調蛋白組成三元復合物[16]，被激活時參與平滑肌細胞收縮反應，具體的機制有待在腎內動脈平滑肌中進一步探討。