李少將，蘇文靈，徐 磊，李治建，劉砥威，鄭瑞芳，邢建國

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，3. 新疆維吾爾藥實驗室，新疆 烏魯木齊 830002；4. 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830049)

隨著醫(yī)療質(zhì)量和診療能力的提升，癌癥患者生存率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，但其治療過程中的心臟毒性已引起社會的廣泛關(guān)注。阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類抗癌藥物，能有效治療各種惡性腫瘤，但因其劑量依賴性的心臟毒性限制了其臨床應(yīng)用[1]。研究表明，內(nèi)皮細胞是心血管系統(tǒng)的重要組成部分，在維持血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[2]。DOX所致心臟毒性小鼠可見冠狀動脈微血管損傷，心臟毛細血管面積明顯減少，抑制內(nèi)皮功能，造成心肌損傷[3]。因此，探討內(nèi)皮功能障礙在DOX心臟毒性中的作用及機制，可能為防治阿霉素心臟毒性提供新的方向。

血管內(nèi)皮生長因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)是血管內(nèi)皮生長因子家族成員之一，在心臟中的表達最為豐富，VEGF-B在病理條件下對血管存活至關(guān)重要[4]。有研究報道，VEGF-B可促進冠狀動脈生成、缺血抵抗，抑制DOX誘導(dǎo)的心肌萎縮，抑制內(nèi)皮功能障礙，保護內(nèi)皮細胞，是預(yù)防DOX所致心臟毒性有意義的候選指標(biāo)[4-6]。

香青蘭又名巴迪然吉布亞，為唇形科野芝麻亞科青蘭屬植物香青蘭DracocephalummoldavicaL.的干燥地上部分，在新疆地區(qū)資源尤其豐富，臨床上主要用于心血管疾病的治療且療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮(total flavonoids ofDracocephalummoldavicaL.，TFDM)可以提高DOX損傷的大鼠心肌細胞的存活率，抑制心肌細胞線粒體功能障礙[7]，從而發(fā)揮抑制DOX心臟毒性作用，但其對內(nèi)皮細胞的保護作用尚未研究。因此，本研究擬探討TFDM對DOX誘導(dǎo)HUVEC細胞損傷和內(nèi)皮功能障礙的保護作用及分子機制，進而尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑TFDM(質(zhì)量分數(shù)：60.60%～62.35%)由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所自制[8](批號:20180406)；DMEM無糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；0.25% 胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；CCK-8試劑盒、廣譜磷酸酶抑制劑購自美國博士德生物；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所; SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；RIPA強裂解液、苯甲基黃酰氟化物PMSF試劑、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自北京索萊寶科技有限公司；彩色蛋白marker購自美國Thermo Fisher公司；VEGF-B抗體(ab185696)、VEGF Receptor 1抗體(ab32152)、Neuropilin 1抗體(ab81321)、p-eNOS抗體(Ab215717)、SRC抗體(ab40660)、ET-1抗體(ab2786)購自英國Abcam公司；AMPKα抗體(CST2532)、p-AMPKα抗體(CST2535)、eNOS抗體(CST32027s)、FAK抗體(3285s)購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自中國中杉金橋公司；ECL發(fā)光液購自美國Millipore。

1.2 主要儀器細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；多功能微孔板檢測儀購自瑞士TECAN SPARK公司；多功能成像系統(tǒng)購自法國VILBER公司；電泳儀和電泳槽裝置購自美國BIO-RAD公司；臺式高速冷凍離心機TGL-16k購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 細胞株及細胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司，培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中。當(dāng)內(nèi)皮細胞生長至融合度達85%～90%時，用胰酶-EDTA(0.25%)溶液消化細胞，并將其置于細胞培養(yǎng)箱中(37 ℃、5% CO2)進行傳代培養(yǎng)，在細胞對數(shù)生長期進行實驗。

1.4 DOX損傷細胞模型建立及分組給藥HUVEC細胞隨機分為對照組、模型組和TFDM各濃度組(25、50、100 mg·L-1)。TFDM預(yù)處理12 h后用1 μmol·L-1的DOX誘導(dǎo)24 h[9-10]，模擬DOX損傷內(nèi)皮細胞的病理變化。

1.5 細胞活力檢測將HUVEC細胞(5×107個·L-1)接種于96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，按照“1.4”項下分組及處理，按照CCK-8試劑盒說明書方法檢測細胞活力，多功能微孔板檢測儀在450 nm波長處測定各組吸光度值(optical density，OD)。

細胞存活率/% =(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%

1.6 HUVEC細胞形態(tài)學(xué)觀察取對數(shù)生長期HUVEC細胞，制備成細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2.5×108個·L-1,每孔2 mL，將細胞接種于6孔培養(yǎng)板。按照“1.4”項下方法分組及處理，倒置顯微鏡下觀察HUVEC形態(tài)改變。

1.7 細胞內(nèi)LDH和SOD檢測將HUVEC細胞(5×107個·L-1)接種于96孔板，按照“1.4”項下方法分組和給藥造模，每組設(shè)置6個復(fù)孔，按照檢測試劑盒說明書測定細胞損傷后釋放的乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平。本實驗進行3次獨立實驗。

1.8 MMP檢測取對數(shù)生長期HUVEC細胞，將細胞接種于6孔培養(yǎng)板，細胞按1.4項下方法分組和給藥造模，每個實驗組設(shè)置3個復(fù)孔。去除培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入1 mL培養(yǎng)基和1 mL配制好的JC-1染色工作液，混勻，置于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中于孵育20 min。孵育結(jié)束后，JC-1染色緩沖液清洗2次，加入細胞培養(yǎng)液，在同一放大倍數(shù)熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機選取3個視野進行拍照，采用ImageJ軟件對拍照結(jié)果紅綠熒光的熒光強度進行分析，取各孔3個視野的均值進行統(tǒng)計。本實驗進行3次獨立實驗。

1.9 HUVEC細胞遷移能力檢測消化、重懸各組待測細胞，以無糖培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×109個·L-1，取200 μL接種至Transwell小室上室，下室中則加入500 μL含10% FBS的高糖培養(yǎng)基。孵育適當(dāng)時間后將小室取出，輕輕擦拭掉上室未遷移的細胞，PBS清洗，4%中性甲醛固定20 min，蘇木精染色30 min。最后在光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察，每組每孔隨機選取5個視野進行計數(shù)，取平均值進行統(tǒng)計分析。本實驗進行3次獨立實驗。

1.10 免疫印跡法(Western blot)檢測相關(guān)蛋白表達取對數(shù)生長期HUVEC細胞，接種于6孔板，按照“1.4”項下分組和給藥造模。棄去細胞上清，用預(yù)冷的PBS洗滌3遍，加入RIPA(強)裂解液(含1% 蛋白磷酸酶抑制劑和1% PMSF)，冰上裂解30 min。低溫離心(12 000 r·min-1、10 min)，使用BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度，按比例加入蛋白上樣緩沖液，金屬浴煮蛋白(95 ℃、5 min)使其變性，-20 ℃冷凍保存。配制SDS-多聚丙烯酰胺凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉。分別加入稀釋好的VEGF-B(ab185696，1 ∶1 000)、VEGF Receptor 1(ab32152，1 ∶1 000)、Neuropilin 1(ab81321，1 ∶1 000)、p-eNOS(Ab215717,1 ∶1 000)、SRC(ab40660，1 ∶1 000)、ET-1(ab2786，1 ∶1 000)、AMPKα(CST2532,1 ∶1 000)、p-AMPKα(CST2535,1 ∶1 000)、eNOS(CST32027s，1 ∶1 000)、FAK(3285s，1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 000)一抗孵育過夜(4 ℃)、TBST(1×)充分漂洗3次，10 min/次，然后加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 000)、山羊抗小鼠IgG(1 ∶2000)二抗室溫孵育2 h，TBST(1×)充分漂洗3次，10 min/次，用ECL顯色液進行顯影。多功能成像系統(tǒng)采集顯影后的圖像，使用ImageJ軟件分析條帶灰度(以GAPDH為內(nèi)參)。

2 結(jié)果

2.1 TFDM對DOX損傷的HUVEC細胞活力的影響如Fig 1A所示，不同濃度的TFDM(1.25、2.5、5、10、25、50和100 mg·L-1)作用于HUVEC細胞36 h，對細胞存活率均無明顯影響，均為無毒濃度。為確定TFDM對DOX損傷是否具有改善作用，本研究采用相應(yīng)濃度TFDM干預(yù)，對HUVEC細胞活力進行測定。與對照組相比較，模型組細胞活力明顯下降；與模型組比較，TFDM的質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50和100 mg·L-1時，細胞存活率明顯升高(P<0.05，F(xiàn)ig 1B)。上述結(jié)果提示，TFDM可改善DOX損傷，使HUVEC細胞活力增強。因此，后續(xù)實驗選用的TFDM質(zhì)量濃度分別為25、50和100 mg·L-1。

Fig 1 The protective effects of TFDM on HUVECs

2.2 HUVEC細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如Fig 2所示，對照組HUVEC細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈長梭形、扁平型、多角形，排列緊密；模型組HUVEC生長停滯，細胞數(shù)量減少，體積縮小，胞質(zhì)中有暗色顆粒，部分變圓，脫落；TFDM低、中、高劑量組細胞多呈長梭形、扁平型、多角形，收縮變圓細胞明顯減少。提示TFDM能夠明顯改善DOX引起的內(nèi)皮細胞形態(tài)學(xué)變化。

Fig 2 Effect of TFDM on morphology of HUVECs induced by DOX (×100)A: Control group; B: DOX group; C: Low dose TFDM group; D: Medium dose TFDM group; E: High dose TFDM group

2.3 TFDM對DOX損傷的HUVEC細胞LDH和SOD水平的影響采用LDH和SOD試劑盒檢測細胞損傷程度。結(jié)果如Fig 3A所示，與對照組比較，模型組細胞LDH 釋放明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，TFDM低、中、高劑量給藥組則明顯降低LDH水平(P<0.05)，提示TFDM能夠減輕或恢復(fù)DOX引起的HUVEC細胞損傷; 結(jié)果如Fig 3B所示，與對照組比較，模型組細胞SOD活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，TFDM干預(yù)后呈劑量依賴性地升高DOX損傷細胞內(nèi)SOD活性(P<0.05)，提示TFDM能夠上調(diào)HUVEC細胞中的SOD活性。

Fig 3 The protective effects of TFDM on HUVECs injured by DOX

2.4 TFDM對DOX損傷的HUVEC細胞線粒體膜電位的影響JC-1是一種廣泛用于檢測MMP的理想熒光探針，采用JC-1標(biāo)記線粒體膜電位的方法評價線粒體功能。當(dāng)線粒體膜電位較高時，JC-1大量聚集在線粒體基質(zhì)中，發(fā)射光以紅色熒光為主；當(dāng)線粒體膜電位較低時，JC-1以單體形式存在，不能聚集在線粒體基質(zhì)中，發(fā)射光則以綠色熒光為主。采用紅綠熒光相對比例來衡量線粒體膜電位變化。結(jié)果如Fig 4所示，與對照組相比較，模型組細胞紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)移，線粒體膜電位明顯降低(P<0.05)，TFDM組與模型組相比，可減少紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)移，TFDM組細胞膜電位升高(P<0.05)，穩(wěn)定線粒體功能，發(fā)揮細胞保護作用。

2.5 TFDM對DOX損傷的HUVEC細胞遷移能力的影響內(nèi)皮細胞遷移，對于維持血管功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用。Transwell小室實驗檢測結(jié)果如Fig 5所示，與對照組相比，模型組穿膜細胞數(shù)量減少(P<0.05)，模型組細胞遷移能力減弱；與模型組相比，TFDM中、高劑量處理組穿模細胞數(shù)量增多(P<0.05)，細胞遷移能力增強；TFDM低劑量處理組與模型組穿膜細胞數(shù)量相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示DOX抑制HUVEC細胞遷移，TFDM可以改善DOX誘導(dǎo)的HUVEC細胞遷移能力，維持血管功能。

Fig 5 Effects of TFDM on migration of HUVECs treated with DOX detected by Transwell assay

2.6 TFDM對DOX損傷的HUVEC細胞內(nèi)皮功能障礙的影響Src和FAK是血管內(nèi)皮屏障功能的主要調(diào)控因素，內(nèi)皮素-1(endothelin 1，ET-1)在維持血管張力和血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[11]。由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化生成的NO是內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的最重要的舒血管因子，可以維持血管平衡穩(wěn)態(tài)[12]。本研究通過Western blot方法對ET-1、FAK、Src和p-eNOS的蛋白表達進行檢測。結(jié)果如Fig 6所示，與對照組比較，DOX處理后的HUVEC細胞ET-1蛋白水平明顯升高，F(xiàn)AK、Src、p-eNOS蛋白水平降低；但與模型組比，TFDM可明顯下調(diào)ET-1蛋白水平，升高FAK、Src和p-eNOS的蛋白表達。提示TFDM可能通過調(diào)控ET-1、FAK、Src和p-eNOS的蛋白表達水平，維持血管張力和血管穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮抑制DOX誘導(dǎo)HUVEC細胞內(nèi)皮功能障礙的作用。

Fig 6 Effects of TFDM on expression of proteins of

2.7 TFDM對DOX損傷的HUVEC細胞VEGF-B/AMPKα通路相關(guān)蛋白表達的影響VEGF-B與內(nèi)皮細胞上的VEGFR1和NRP1受體結(jié)合，激活A(yù)MPKα，增加了內(nèi)皮型一氧化氮合酶含量，從而發(fā)揮促進微血管內(nèi)皮細胞增殖，維持血管屏障完整性，促進微血管穩(wěn)態(tài)的作用。結(jié)果如Fig 7所示，與對照組比較，DOX損傷后HUVEC細胞VEGF-B、NRP1、VEGFR1蛋白表達水平降低，AMPKα蛋白磷酸化水平降低。而TFDM干預(yù)后使VEGF-B、NRP1、VEGFR1、和p-AMPKα蛋白表達水平升高，TFDM抑制阿霉素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷的機制可能與激活VEGF-B/AMPKα通路有關(guān)。

Fig 7 Effects of TFDM on expression of proteins of

3 討論

內(nèi)皮功能障礙是心血管并發(fā)癥的一系列關(guān)鍵病理生理事件，可能導(dǎo)致出血、梗塞、動脈粥樣硬化和再狹窄等。Yin等[13]發(fā)現(xiàn),DOX可以減少心臟內(nèi)皮細胞遷移，抑制血管網(wǎng)形成，降低心臟血管密度。兒童白血病患者經(jīng)DOX治療生存時間超過10年者，其血管內(nèi)皮功能明顯受損，而心臟未見明顯影響[14]，因此，DOX對心臟的毒性作用可能是其對血管內(nèi)皮細胞的影響所繼發(fā)的，說明DOX對血管的損傷可能是其心臟毒性的始動因素。本次實驗通過建立DOX誘導(dǎo)HUVEC內(nèi)皮細胞損傷模型，進行細胞形態(tài)學(xué)和功能學(xué)檢測，證實DOX可以抑制內(nèi)皮細胞增殖，改變內(nèi)皮細胞形態(tài)，增加LDH漏出量，降低SOD活力，降低線粒體膜電位，造成內(nèi)皮細胞損傷。給予TFDM預(yù)保護后，不僅可以促進內(nèi)皮細胞生存和增殖，改善細胞形態(tài)，還可以抑制線粒體功能障礙，從而發(fā)揮抑制DOX損傷的HUVEC細胞的作用。

NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的一種重要血管舒張活性物質(zhì)，與維持心血管穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，具有抑制平滑肌增生，避免血管病理重構(gòu)和管腔狹窄的作用，且主要由eNOS催化生成[12]。內(nèi)皮素(endothelin，ET)是迄今所知最強的縮血管物質(zhì)，廣泛存在于血管內(nèi)皮和各種組織、細胞中，分為3種類型，其中以內(nèi)皮素-1(endothelin 1，ET-1)活性最強，對微循環(huán)的調(diào)節(jié)起著重要作用[15]。一方面eNOS磷酸化水平表達紊亂，可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的損傷；另一方面，ET-1的異常表達常被認為與各種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[16]。在結(jié)構(gòu)上，Src和FAK被認為是通過促進VE-鈣黏蛋白磷酸化來控制內(nèi)皮屏障功能的關(guān)鍵因素[14]。本實驗對 eNOS磷酸化水平、ET-1、FAK、Src蛋白表達水平進行檢測，與模型組比較，TFDM可明顯下調(diào)ET-1蛋白水平，升高FAK、Src和p-eNOS的蛋白表達。提示我們TFDM可能通過調(diào)控ET-1、FAK、Src和p-eNOS的蛋白表達水平，維持血管張力和血管穩(wěn)態(tài)，來發(fā)揮抑制DOX對內(nèi)皮屏障功能和微血管穩(wěn)態(tài)的損傷作用。細胞遷移試驗中，我們發(fā)現(xiàn)，模型組穿過小室的細胞數(shù)量明顯減少，提示DOX誘導(dǎo)HUVEC細胞遷移能力減弱，內(nèi)皮細胞功能受到損傷。而TFDM作用后，穿過的細胞數(shù)目增多，進一步提示我們TFDM可能通過增強 HUVEC細胞遷移能力，保護內(nèi)皮細胞功能，維持微血管穩(wěn)態(tài)。

血管內(nèi)皮生長因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)是在1996年作為VEGF同源物被發(fā)現(xiàn)，在高代謝活性的組織如心肌、骨骼肌中表達最為豐富。據(jù)文獻報道，VEGF-B可以改善DOX誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮細胞功能障礙，防止心臟毛細血管稀疏，改善線粒體呼吸，保護內(nèi)皮細胞免于凋亡，并恢復(fù)其成管功能[4]。VEGF-B通過與內(nèi)皮細胞上的血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1)和神經(jīng)纖毛蛋白1(NRP1)受體結(jié)合[17-18]，進一步激活A(yù)MPKα，增加了內(nèi)皮型一氧化氮合酶含量，從而發(fā)揮促進微血管內(nèi)皮細胞增殖，維持血管屏障完整性，促進微血管穩(wěn)態(tài)的作用。此研究中通過Western blot法檢測VEGF-B/AMPKα通路相關(guān)蛋白表達情況證實，DOX損傷HUVEC細胞后，明顯抑制VEGF-B蛋白表達，其受體NRP1、VEGFR1表達也受到抑制，p-AMPKα/AMPKα蛋白表達降低，VEGF-B/AMPKα通路在DOX損傷HUVEC細胞中發(fā)揮重要作用。給予TFDM預(yù)保護后，TFDM可以激活阿霉素誘導(dǎo)的HUVEC細胞VEGF-B/AMPKα信號通路。

綜上所述，TFDM可明顯抑制DOX引起的內(nèi)皮細胞損傷。同時增強了VEGF-B/AMPKα信號通路活性，但TFDM是否通過激活VEGF-B/AMPKα信號通路發(fā)揮抑制DOX引起的內(nèi)皮細胞損傷作用是我們需要進一步探討的問題。后續(xù)試驗將主要通過小分子RNA干擾抑制VEGF-B和AMPKα表達，對TFDM如何調(diào)控DOX引起的內(nèi)皮細胞損傷進行蛋白和基因水平上深層次的研究。