趙麗蓉，李雯，張建平*，劉自剛，齊燕妮，李聞娟，謝亞萍

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)資源創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，甘肅 蘭州 730070）

胡麻（Linumu usitatissimum L.）屬于亞麻科亞麻屬，自花授粉，是一年生草本植物（2n＝2x＝30）。胡麻作為我國(guó)西北和華北地區(qū)主要的油料及經(jīng)濟(jì)作物，具有耐旱、耐寒、耐瘠薄等特點(diǎn)［1-2］。

雜草防除是胡麻種植工作中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，雜草若不及時(shí)除掉很容易形成草荒，造成減產(chǎn)。胡麻多采用窄行密植栽培，而且生育期雜草種類多、數(shù)量大，難以進(jìn)行中耕除草，且人工除草成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來化學(xué)除草劑已經(jīng)在胡麻種植中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)胡麻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)起到了巨大的作用［3］。使用除草劑對(duì)雜草進(jìn)行化學(xué)防治，具有高效、經(jīng)濟(jì)、省力等優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)際生產(chǎn)中，人們往往關(guān)注的是除草劑的除草效果，而忽視了其對(duì)作物的危害，若除草劑使用濃度和方法不當(dāng)，會(huì)使作物產(chǎn)生藥害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［4-5］。

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑具有高效低毒、施用期長(zhǎng)、對(duì)后茬作物安全等優(yōu)點(diǎn)，其作用原理是通過抑制ACCase的羧化反應(yīng)，使植物脂肪酸合成受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，造成相關(guān)代謝產(chǎn)物滲漏，最終導(dǎo)致植物死亡［6］。蓋草能屬于ACCase抑制劑類除草劑，對(duì)禾本科雜草具有極強(qiáng)的防效功能，在全世界范圍內(nèi)廣泛使用。在我國(guó)，高效蓋草能已有多年的使用歷史，主要用于油菜、棉花、大豆、油葵、紅花、甜菜、亞麻、瓜類、苜蓿、甘草、胡蘿卜、蔥、蒜、薯類、蔬菜等多種闊葉作物［7］。雖然對(duì)其產(chǎn)生抗性的雜草至今尚未有相關(guān)的報(bào)道，但長(zhǎng)期單一使用，會(huì)導(dǎo)致雜草對(duì)蓋草能的敏感性逐漸下降，而除草劑用量的加大會(huì)對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育造成一定的影響［8］。胡麻是雙子葉植物，具有異質(zhì)型ACCase，對(duì)蓋草能有一定的抗性。本研究采用蓋草能對(duì)隴亞14號(hào)進(jìn)行處理，評(píng)價(jià)蓋草能不同處理下隴亞14號(hào)的安全性，結(jié)合蓋草能靶標(biāo)基因AccA的表達(dá)，旨在為科學(xué)合理使用蓋草能提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步培育抗蓋草能胡麻種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試胡麻品種隴亞14號(hào)由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所胡麻課題組提供。供試材料于2021年3月種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)基地（36°03′N，103°40′E，海拔1500m），出苗后30 d對(duì)胡麻幼苗進(jìn)行蓋草能處理。

1.2 蓋草能處理與樣品采集

供試藥劑為10.8%蓋草能乳油（高效氟吡甲禾靈），美國(guó)陶氏益農(nóng)公司生產(chǎn)。配制3種不同濃度的蓋草能藥劑（5、10、15 mL/L），用3種濃度的蓋草能分別對(duì)隴亞14號(hào)幼苗進(jìn)行噴霧處理，每種濃度均勻噴霧一次，用量為80 mL。蓋草能處理的同時(shí)取未施藥的隴亞14號(hào)葉片作為對(duì)照，在蓋草能處理后3 h、6 h、24 h、7 d分別采集3種不同濃度處理的隴亞14號(hào)葉片，所有采取的樣品用液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 組織樣總RNA提取及cDNA合成

用試劑盒Plant Easy Spin RNAMiniprep Kit（BIOMIGA，USA）提取各樣品RNA，隨后利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)和凝膠電泳對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。用試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kitwith gDNA Eraser（Perfect Real Time；TaKaRa）去除基因組DNA并合成cDNA，檢測(cè)其濃度和質(zhì)量后保存于-20℃冰箱用于qRT-PCR分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)胡麻AccA基因CDS序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1）。以GAPDH為內(nèi)參基因，使用2×SYBR Mixture（Biomiga）熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系為20μL：2×SYBR Mixture 10μL、正向引物（10μmol/L）1μL、反向引物（10μmol/L）1μL、cDNA模板（100 ng/μL）2μL、無 RNase水 6μL。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min、95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃15 s、72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s、65℃ 1min、97℃ 1 s。每個(gè)樣品3次重復(fù)。運(yùn)用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量［9］，最后利用Microsoft Excel 2019軟件作圖。

表1 熒光定量引物Table 1 Fluorescent quantitative primers

2 結(jié)果與分析

2.1 蓋草能處理對(duì)胡麻幼苗的影響

施用蓋草能后分別在3 h、6 h、24 h和7 d觀察不同處理下胡麻幼苗的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)不同處理的蓋草能對(duì)胡麻幼苗的損傷程度隨時(shí)間發(fā)生不同程度的變化（圖1）。與對(duì)照相比，施藥3 h后，噴施5 mL/L蓋草能的胡麻幼苗少量葉片出現(xiàn)模糊的條狀淺斑，植株整體未出現(xiàn)萎蔫，莖部正常，未發(fā)生藥害，生長(zhǎng)狀況良好；噴施10 mL/L蓋草能時(shí)多數(shù)葉片發(fā)生藥害，出現(xiàn)條狀淺斑，葉片無萎蔫干枯，植株莖部下段發(fā)生輕微藥害，植株總體生長(zhǎng)狀態(tài)良好；噴施15 mL/L蓋草能的植株葉片多數(shù)出現(xiàn)深色藥害斑塊，少數(shù)下部葉片變黃，莖下部出現(xiàn)輕微藥害，有淺色條斑但并不明顯，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。施藥6 h后，噴施5 mL/L和10 mL/L蓋草能時(shí)少量植株藥害加強(qiáng)，葉片表面斑塊顏色加深，但整體葉片顏色仍保持綠色，生長(zhǎng)未受到明顯影響，與施藥3 h的表現(xiàn)無明顯差異；噴施15 mL/L蓋草能時(shí)植株多數(shù)葉片尖部出現(xiàn)干枯，葉片表面藥害條斑擴(kuò)散為片狀，少數(shù)葉片甚至出現(xiàn)萎蔫，蜷縮。施藥24 h后，噴施5 mL/L蓋草能的植株少數(shù)葉片藥害減輕，葉片表面的條狀淺斑部分消失，植株進(jìn)入藥害恢復(fù)階段；噴施10 mL/L蓋草能的植株少數(shù)葉片表面藥害形成的條斑由1條增至2～3條，極少數(shù)矮小植株頂部葉片大面積受到藥害，莖部條斑顏色明顯加深；噴施15 mL/L的植株葉片絕大多數(shù)發(fā)生藥害，多數(shù)葉片干枯蜷縮，植株萎蔫嚴(yán)重，莖部整體受損嚴(yán)重，出現(xiàn)褐色片狀斑。施藥7 d后，噴施5 mL/L蓋草能的植株已完全恢復(fù)正常生長(zhǎng)，與對(duì)照無明顯差別；噴施10 mL/L蓋草能的植株少數(shù)葉片仍有干枯，但植株莖部基本恢復(fù)正常，藥害有明顯緩解，植株進(jìn)入恢復(fù)階段；噴施15 mL/L蓋草能的植株部分葉片干枯發(fā)黃，植株莖部藥害斑減輕減少，藥害植株僅有輕微的恢復(fù)。與對(duì)照相比，噴施5 mL/L蓋草能的胡麻植株恢復(fù)后與對(duì)照無明顯差異，噴施15 mL/L蓋草能的胡麻植株受藥害較為嚴(yán)重，而噴施10 mL/L蓋草對(duì)植株雖有藥害但基本可以恢復(fù)正常生長(zhǎng)。對(duì)處理后不同時(shí)間的植株高度分析發(fā)現(xiàn)（圖2），噴施15 mL/L蓋草能藥劑的植株較其他兩個(gè)處理矮。

圖1 蓋草能不同處理后胡麻幼苗形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of flax seedlings after spraying different treatments of haloxyfop-r-methyl

圖2 蓋草能不同處理后植株株高Fig.2 Plant height of flax under different treatments of haloxyfop-r-methyl

2.2 蓋草能處理后植株的枯萎率

對(duì)3種不同濃度蓋草能處理下植株的枯萎率進(jìn)行分析（圖3），結(jié)果表明，5 mL/L蓋草能處理下，其在各時(shí)段枯萎率均為0，說明在此濃度下，植株生長(zhǎng)狀況良好，無枯萎植株；10 mL/L蓋草能處理下，隨著時(shí)間變化植株枯萎率呈先增后減趨勢(shì)，分別為0、10%、30%、25%，說明在此濃度下，植株前期受藥害嚴(yán)重導(dǎo)致枯萎植株增加，在處理后7 d，部分枯萎植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)，植株整體進(jìn)入恢復(fù)階段；15 mL/L蓋草能處理下，植株枯萎率持續(xù)增長(zhǎng)，分別為0、15%、45%、60%，說明植株一直處于藥害階段，難以恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

圖3 蓋草能不同處理后植株枯萎率Fig.3 The withering rate of plants after spraying different treatments of haloxyfop-r-methyl

2.3 蓋草能脅迫下AccA基因表達(dá)分析

在蓋草能處理后不同時(shí)期采集葉片，通過qRT-PCR分析其靶標(biāo)基因AccA的表達(dá)模式。由圖4可知，AccA在所采集的13個(gè)樣品中均有表達(dá)，且在噴施15 mL/L蓋草能后24 h的葉片中表達(dá)量明顯高于其他處理的葉片。隨著時(shí)間的變化，AccA的表達(dá)量總體呈先增后減的趨勢(shì)，且均在處理后24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。在蓋草能處理后6 h和24 h時(shí)，AccA基因表達(dá)量因蓋草能濃度不同而不同，呈現(xiàn)為 15 mL/L＞10 mL/L＞5 mL/L，均在噴施 15 mL/L時(shí)表達(dá)量最高，且 24 h時(shí)表達(dá)量差異更加顯著。

圖4 蓋草能脅迫下AccA基因的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of AccA under haloxyfop-r-methyl stress

2.4 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明，藥劑濃度與植株枯萎率呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.624；處理時(shí)間與株高呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.963；其余各性狀間不相關(guān)或是相關(guān)性不顯著（表 2）。

表2 相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis

續(xù)表2

3 討論

雜草對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅［10］。有研究［11-12］表明，施用化學(xué)除草劑可以有效抑制雜草生長(zhǎng)，從而提高作物的產(chǎn)量，但化學(xué)除草劑對(duì)于作物而言是一種脅迫因子，過量施用也會(huì)導(dǎo)致作物生長(zhǎng)緩慢甚至死亡。蓋草能是一種選擇性殺滅有害草類的除草劑，能被葉片吸收并運(yùn)輸至整個(gè)植株，安全性高，已被廣泛應(yīng)用于油菜、棉花等作物除草工作中［13-15］，但在胡麻中相關(guān)研究較少?；诖吮狙芯繉?duì)蓋草能在胡麻田中的安全應(yīng)用及其靶標(biāo)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了相關(guān)研究。

蓋草能屬于ACCase抑制劑類除草劑，胡麻具有異質(zhì)型ACCase，對(duì)其有一定的抗性。蓋草能靶標(biāo)基因AccA的表達(dá)量可以反映植株對(duì)蓋草能的敏感度。本研究發(fā)現(xiàn)蓋草能脅迫處理下，AccA基因在胡麻葉片中的表達(dá)量隨時(shí)間變化呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，適量施用蓋草能對(duì)胡麻植株沒有明顯的藥害影響，植株會(huì)恢復(fù)正常生長(zhǎng)；過量噴施會(huì)抑制胡麻生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)胡麻的生長(zhǎng)有明顯的藥害，表現(xiàn)為葉色失綠，葉片萎蔫，莖葉出現(xiàn)不同程度藥害斑等，植株矮小，而且難以恢復(fù)正常生長(zhǎng)，這與前人研究結(jié)果一致［12］。另外，對(duì)處理植株進(jìn)行枯萎率及相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，藥劑濃度越高，植株枯萎率越高，二者之間呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），處理時(shí)間與株高呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。

本研究旨在研究不同濃度蓋草能處理下胡麻植株的生長(zhǎng)狀況及其靶標(biāo)基因AccA的表達(dá)模式，結(jié)合相關(guān)性分析，為胡麻種植中科學(xué)合理使用蓋草能提供理論依據(jù)，從而為進(jìn)一步培育抗蓋草能胡麻種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

胡麻幼苗經(jīng)蓋草能處理后，隨著時(shí)間的變化植株出現(xiàn)了不同程度的藥害現(xiàn)象，且噴施蓋草能濃度越大藥害越嚴(yán)重，植株較矮小，噴施10 mL/L蓋草能對(duì)胡麻植株相對(duì)安全，植株可以恢復(fù)正常生長(zhǎng)，與對(duì)照植株無明顯差異；AccA基因作為蓋草能靶標(biāo)基因，其表達(dá)量隨時(shí)間變化呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且在施藥24 h后達(dá)到最高；藥劑濃度與植株枯萎率呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），處理時(shí)間與株高呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。