葉圓圓, 顏曉紅, 李友筑

（廈門大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，福建 廈門 361005）

隨著輔助生殖技術的蓬勃發(fā)展，目前該技術已經成為治療不孕不育癥的最有效方法之一。近年來我國不孕不育癥發(fā)病率逐年上升，加之二胎政策開放及生育年齡推遲，使得輔助生殖技術在臨床上廣泛開展。體外受精/卵胞漿內單精子注射（in-vitrofertilization/intracytoplasmic sperm injection， IVF/ICSI）為輔助生殖醫(yī)學中較為成熟的治療手段，但其助孕結局受多種因素影響，對相關結局預測指標的研究也是生殖領域的重點之一。目前大部分研究主要進行單因素分析，已發(fā)現(xiàn)女方年齡、控制性卵巢刺激過程、胚胎的發(fā)育狀況、胚胎著床的子宮環(huán)境和行胚胎移植術的技術水平等因素對IVF/ICSI治療的妊娠結局有直接或間接的影響，而涉及輔助生殖全過程的多因素分析鮮有報道。為了綜合分析影響體外受精鮮胚移植后妊娠發(fā)生的相關因素，提高鮮胚移植的臨床妊娠率，本研究回顧性分析在本中心行IVF/ICSI 治療的635 個鮮胚移植周期的臨床資料，綜合分析了包括一般資料、促排周期情況和胚胎實驗室情況三方面共29 項指標與妊娠結局的關系，旨在為臨床個體化鮮胚移植策略的制定和妊娠概率預測提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象和分組選擇2017年5月—2020年4月在本中心進行IVF/ICSI 治療的鮮胚移植周期，排除臨床資料不全和子宮異常（先天性畸形、肌瘤、息肉、宮腔粘連和子宮腺肌癥等）的周期，最終本研究共納入635 個鮮胚移植周期。根據(jù)胚胎移植后28～30 d 行陰道超聲檢查子宮腔內是否有孕囊將妊娠結局分為臨床妊娠組和未妊娠組，臨床妊娠組354 例，未妊娠組281 例。

1.2 臨床觀察指標指標包括女方年齡、不孕年限、不孕類型（原發(fā)或繼發(fā)）、體質量指數(shù)（body mass index，BMI）、抗繆勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、基礎竇卵泡數(shù)（antra follicle count，AFC） 和不孕原因（盆腔及輸卵管因素、卵巢功能減退、多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥和男方因素等）。

1.3 促排情況相關觀察指標指標包括促性腺激素（gonadotropin，Gn）總量、Gn 天數(shù)、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin， hCG）日血清雌二醇（estradiol，E2）水平、hCG日血清孕酮（progesterone，P）水平、hCG日子宮內膜厚度、hCG日子宮內膜表型（A/A-B、B/B-C 和C）、移植醫(yī)生和促排卵方案。促排卵方案包括長方案、超長方案、拮抗劑方案和其他方案。長方案在卵泡早期或黃體中期給予長效促性腺激素釋放激素激動劑 （gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）進行垂體調節(jié)， 24～28 d 后當達到降調節(jié)標準時使用Gn 進行超促排卵；超長方案在卵泡早期或黃體中期開始給予長效GnRH-a，28 d 后再次給予長效GnRH-a 1～2 次，最后一次降調后14 d當達到降調節(jié)標準時使用Gn 進行超促排卵；拮抗劑方案在月經第2～3 天開始使用Gn，Gn 第5～7 天時加用促性腺激素釋放激素拮抗劑（gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRHA）直至扳機日。所有方案當觀察到患者含有≥1 個卵泡直 徑≥18 mm 或≥3 個 卵 泡 直 徑≥17 mm，外周血E2 水平達到平均每個優(yōu)勢卵泡約200 ng·L－1時，注射hCG 6000～8000 IU，35～37 h后取卵。

1.4 胚胎實驗室觀察指標指標包括受精方式（IVF 或ICSI）、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)（MⅡ卵數(shù)）、第3 天（D3）可用胚胎數(shù)、D3 優(yōu)質胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、移植胚胎平均評分（優(yōu)質胚胎記2 分，非優(yōu)質胚胎記1 分）、移植胚胎類型（D3 卵裂胚或D5囊胚）。卵裂期胚胎評分標準：Ⅰ級，卵裂球大小均勻、規(guī)則，有較完整的透明帶，無核碎片的含量＜10%；Ⅱ級，卵裂球大小略不均勻、稍欠規(guī)則，無核碎片含量為10%～30%；Ⅲ級，卵裂球大小略不均勻、稍欠規(guī)則，無核碎片含量為30%～50%；Ⅳ級，卵裂球明顯不均勻、不規(guī)則，碎片含量＞50%。6 細胞以上的Ⅲ級卵裂胚為可用卵裂胚，6 細胞以上的Ⅰ級和Ⅱ級卵裂胚為優(yōu)質卵裂胚。囊胚期胚胎根據(jù)形態(tài)學分級進行評估，優(yōu)質囊胚包括≥3AA、3-6AB 和3-6BA。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)性觀察指標以±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗；分類性觀察指標以構成比（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher 精確概率法檢驗。將差異有統(tǒng)計學意義和臨床意義的指標作為自變量（納入標準P＜0.25），將移植后是否臨床妊娠作為因變量，建立Logistic 模型，采用似然比檢驗法進行逐步回歸分析，采用Logistic回歸模型的比值比（odds ratio，OR）及其95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）評估各指標與鮮胚移植結局的關聯(lián)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床妊娠組和未妊娠組各觀察指標本研究共納入635 個周期，其中臨床妊娠組354 個周期，未妊娠組281 個周期，總體妊娠率為55.75%。本研究中患者臨床觀察指標、促排情況相關觀察指標和實驗室觀察指標的分析結果見表1～3。臨床妊娠組在女方年齡、hCG日血清P 水平、hCG日血清P/E2×1000 和hCG日血清P/MⅡ卵數(shù)中明顯低于未妊娠組（P＜0.25），而AFC、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、D3 可用胚胎數(shù)、D3 優(yōu)質胚胎數(shù)和移植胚胎數(shù)明顯高于未妊娠組（P＜0.25）。移植胚胎的平均評分不同其臨床妊娠結局分布差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.015），其中移植胚胎平均評分為1.0 時臨床妊娠占比明顯低于評分為2.0 時（P=0.005）。不同促排卵方案的妊娠結局分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），與拮抗劑方案比較，長方案和超長方案結局為臨床妊娠的占比較高（P=0.002 和P=0.006）。而臨床妊娠組與未妊娠組不孕年限、BMI、AMH、Gn 天 數(shù)、Gn 總 量、hCG日 血 清E2水平、hCG日子宮內膜厚度、不孕原因、hCG日子宮內膜表型、移植醫(yī)生、受精方式和移植胚胎類型比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.25）。

表1 2 組患者一般資料Tab.1 General information of patients in two groups

2.2 鮮胚移植結局的多因素Logistic 回歸分析將單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的14 個觀察指標作為自變量納入多因素Logistic 回歸模型。對納入的自變量作相關分析和共線性分析，獲卵數(shù)與MⅡ卵數(shù)、D3 可用胚胎數(shù)與D3 優(yōu)質胚胎數(shù)的相關系數(shù)（r）分別為0.922 和0.921，方差膨脹因子均大于5，不宜同時納入回歸模型，結合臨床意義，排除獲卵數(shù)與D3 優(yōu)質胚胎數(shù)，最終共納入12 個自變量。對連續(xù)變量包括年齡、M Ⅱ卵數(shù)、AFC、hCG日血清P 水平和D3 可用胚胎數(shù)進行分組，分別以35 歲、10 個、15 個、1.0 μg·L－1和4 個為界各分為2 組，具體賦值方法見表4。結果顯示：女方年齡、AFC、hCG日血清P 水平、D3 可用胚胎數(shù)和移植胚胎數(shù)是鮮胚移植結局的獨立影響因素（表5）。經多因素Logistic 回歸分析模型檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=49.794，P＜0.001）?！?5歲女性臨床妊娠率較＜35 歲女性臨床妊娠率降低45.4% （OR=0.546，OR95%CI：0.370～0.806，P=0.002）；移植2 枚胚胎的臨床妊娠率是單胚胎移 植 的 1.947 倍 （OR=1.947， OR95%CI：1.375～2.757，P＜0.01）；與hCG日 血 清P 水平＜1.0 μg·L－1的周期比較，hCG日血清P 水平≥1.0 μg·L－1的 周 期 妊 娠 率 降 低38.1% （OR=0.619， OR95%CI： 0.437～0.877，P=0.007）。AFC＞15 個（OR=1.485， OR95%CI： 1.036～2.129，P=0.031）和D3 可用胚胎數(shù)＞4 個（OR=1.775，OR95%CI：1.240～2.541，P=0.002）的臨床妊娠率分別增加1.485 倍和1.775 倍。

表4 多因素Logistic 回歸分析變量賦值方法Tab.4 Assignment method of multiple Logistic regression analysis

表5 鮮胚移植結局的多因素Logistic 回歸分析Tab.5 Multiple Logistic analysis of fresh embryo transfer outcome

表2 2 組患者促排過程相關觀察指標Tab.2 Hyperovulation process-related indicators of patients in two groups

3 討論

女方年齡是影響鮮胚移植結局的重要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)≥35 歲女性鮮胚移植妊娠率較＜35 歲女性降低了45.4%，與其他研究［1］結果一致。除鮮胚移植外，女方年齡也影響凍胚移植的妊娠率、雙胚胎移植后多胎妊娠的發(fā)生率和單胚胎移植后單卵雙胎的發(fā)生率［2-5］。高齡是各種不良妊娠結局的獨立危險因素［6-7］。隨著年齡的增長，卵巢內儲備的卵母細胞數(shù)量逐漸減少，卵母細胞的整體質量下降，復雜非整倍體的比例上升，可能影響卵母細胞的受精能力和胚胎的發(fā)育潛能［8］。另外，卵巢儲備功能的下降可能引起激素環(huán)境改變，從而使子宮內膜容受性降低，影響妊娠結局。FOGLE等［9］研究發(fā)現(xiàn)：子宮內膜中細胞因子HOXA10 基因的表達與年齡呈負相關關系，提示年齡可能從分子水平對子宮內膜容受性造成影響。

P 是支持成功妊娠的重要甾體激素，理論上hCG日血清P 水平可能與卵母細胞的質量有關，P 水平過低提示卵子成熟度欠佳，P 水平過高則提示內源性LH 峰提前，使卵泡過早黃素化，從而對卵母細胞和胚胎質量產生影響。但有研究［10-11］顯示：P 水平的變化不會對胚胎質量造成明顯的影響。hCG日血清P 水平與妊娠結局的關系目前也還存在爭議。一部分研究［12-14］認為hCG日血清P 水平升高對妊娠結局無影響，而本研究結果顯示：與hCG日血清P 水平＜1.0 μg·L－1的女性比較，P 水平≥1.0 μg·L－1時 臨 床 妊 娠 率 降 低38.1%。ASHMITA 等［15］研 究 發(fā) 現(xiàn)：hCG日 血 清P 水 平≥1.5 μg·L－1與 妊 娠 結 局 呈 負 相 關 關 系。李 蓉 等［16］對2921 個IVF/ICSI 周期病例的研究發(fā)現(xiàn)hCG日血清P 水平升高組（P 水平＞1.2 μg·L－1） 較P 水平正常組在新鮮周期的臨床妊娠率明顯下降。目前普遍認為P 水平升高導致的臨床妊娠率降低可能與子宮內膜容受性降低有關。另外，有學者提出hCG日 血清P 水平、MⅡ卵數(shù)［17］和hCG日P/E2［18］比單獨的P 水平預測妊娠率更有價值，本研究單因素分析結果也顯示這2 項指標與妊娠結局具有一定的相關性，但并非結局預測的獨立影響因素。

本研究結果顯示：AFC＞15 個可增加臨床妊娠發(fā)生率。雖然有研究［19-20］提示AFC 可與其他指標協(xié)同在IVF 治療結局預測中具有一定的作用，但作用效果鮮有報道。目前AFC 在臨床上主要用作與AMH 和FSH 等協(xié)同評估卵巢的儲備功能。胚胎質量也是影響妊娠結局的關鍵因素之一，本研究結果表明：D3 可用胚胎數(shù)＞4 個明顯升高鮮胚移植的臨床妊娠率，提示臨床應用中可考慮將D3 可用胚胎數(shù)＞4 個作為鮮胚移植的條件之一。

表3 2 組患者實驗室相關觀察指標Tab.3 Laboratory-related indicators of patients in two gruops

移植胚胎數(shù)目是臨床上一個比較容易控制的因素，增加移植胚胎數(shù)能提高妊娠概率。本研究結果也表明移植2 枚胚胎的臨床妊娠率是單胚胎移植的1.947 倍。但增加移植胚胎數(shù)可能升高多胎率。根據(jù)2016年中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會數(shù)據(jù)報告統(tǒng)計：我國生殖醫(yī)學中心多胎妊娠率達30%以上［21］；美國輔助生殖技術協(xié)會數(shù)據(jù)顯示：2017年通過IVFET 新鮮移植周期妊娠者中有26.4%是多胎妊娠，明顯高于自然妊娠的3.4%［22］。為了降低多胎妊娠率，越來越多學者推崇“One time one baby”的選擇性單胚胎移植策略（selective single embryo transplant，eSET）［23］。雖然單胚胎移植能降低多胎率，但其造成的妊娠率降低和費用增加是限制其臨床應用的主要原因。如何在不降低妊娠率的情況下有效地從根本上減少醫(yī)源性多胎妊娠的發(fā)生，還需要對eSET 的指征和效果進行更深入的研究。蘇敏等［24］關于移植胚胎數(shù)目、級別與妊娠結局關系的研究中建議任何年齡移植胚胎數(shù)不多于2 枚，移植Ⅰ級胚胎數(shù)不多于1 枚。中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會最新的共識建議提出無論任何年齡、移植周期次數(shù)，建議每周期胚胎移植數(shù)目均≤2 枚［21］。本研究中所有周期的移植胚胎數(shù)目均≤2 枚，且雙胚胎移植的胚胎類型主要為卵裂胚，只有3 個周期為囊胚。本文作者認為移植胚胎數(shù)不超過2 枚卵裂胚可在提高妊娠率的同時又不至于使多胎妊娠率過高，吳紅萍等［25］在輔助生殖質控中心提出IVF-ET 移植胚胎數(shù)不多于2 枚的策略實施前后，對北京市各生殖中心的移植胚胎數(shù)和多胎妊娠率的調查中也發(fā)現(xiàn)每移植周期胚胎數(shù)不超過2 個，既保證了臨床妊娠率和活產率不下降，也能有效控制多胎妊娠率。

綜上所述，女方年齡、AFC、hCG日血清P 水平、D3 可用胚胎數(shù)和移植胚胎數(shù)是鮮胚移植結局的獨立影響因素。女方年齡＜35 歲、AFC＞15 個、hCG日血清P 水平＜1.0 μg·L－1、D3 可用胚胎數(shù)＞4 個和移植2 枚胚胎有助于提高鮮胚移植的臨床妊娠率，臨床上制定個體化鮮胚移植策略時可酌情參考。