方 圓, 劉曉璇, 王 瑞

（1. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔預(yù)防科，吉林 長春 130021；2. 吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021）

齲病是一種發(fā)生于牙體硬組織的慢性感染性疾病，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為三大慢性非傳染性疾病之一，其主要致病菌為變異鏈球菌［1］。變異鏈球菌為革蘭陽性菌，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸和耐酸能力，其胞壁表面物質(zhì)有助于細(xì)菌的黏附、定植和聚集，從而有助于形成生物膜，研究［2-3］表明：生物膜中的變異鏈球菌比浮游狀態(tài)時(shí)更能抵抗抑菌藥物及宿主的免疫功能，因此抑制變異鏈球菌的生長及生物膜形成是防齲工作的關(guān)鍵。目前氟化鈉（sodium fluoride，NaF）是臨床上使用范圍最廣和最有效的防齲物質(zhì)，其能降低釉質(zhì)溶解度、促進(jìn)釉質(zhì)再礦化及改變牙萌出后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，還能對致齲菌的代謝產(chǎn)生影響，如抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性等［4-5］，但NaF 使用不當(dāng)易出現(xiàn)氟牙癥和耐氟菌株等一系列不良反應(yīng)［6］。而中藥不僅能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制細(xì)菌生長，還能延緩細(xì)菌的耐藥性，因此中藥抑菌現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)之一［7］。人參皂苷作為我國傳統(tǒng)中藥材人參中的主要活性成分，近年來已有研究［8-9］證明其對多種細(xì)菌均有抑制作用。但人參皂苷聯(lián)合NaF 是否能夠增強(qiáng)抑菌效果國內(nèi)外尚未見報(bào)道，因此本研究選擇將人參皂苷Rh2 型（ginsenoside Rh2，GRh2）與NaF 聯(lián)合應(yīng)用于變異鏈球菌，探討2 種藥物是否具有協(xié)同抑菌作用，是否在減少NaF 使用劑量的同時(shí)增強(qiáng)對變異鏈球菌的抑制作用，為開發(fā)更有效的防齲產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌、主要試劑和儀器變異鏈球菌UA159由吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。G-Rh2（上海源葉生物科技有限公司），NaF（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司），腦心浸出液肉湯（brain heart infusion，BHI）（賽默飛世爾科技公司），蔗糖（北京索萊寶科技有限公司），結(jié)晶紫染料（北京酷來博科技有限公司），戊二醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。二氧化碳細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司），分光光度計(jì)（上海尤尼科有限公司），pH 值檢測儀（上海雷磁新涇儀器有限公司），抽氣式厭氧罐（上海坤科儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和菌液制備將－80 ℃凍存的變異鏈球菌復(fù)蘇后接種于BHI 瓊脂板中，于37 ℃、5%CO2厭氧條件下培養(yǎng)24 h，掃描電鏡鑒定為純培養(yǎng)后挑取單菌落接種于含1%蔗糖的BHI 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 半數(shù)最小抑菌濃度（half minimum inhibition concentration，MIC50）的測定通過微量稀釋法分別測量G-Rh2 與NaF 對變異鏈球菌的MIC50值。分別將等量的菌液和不同濃度的藥物加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，菌液最終濃度為1×106CFU·mL－1，G-Rh2 的濃度為12.5、15.0、20.0、25.0、30.0 和40.0 mg·L－1， NaF 的 濃 度 為15.625、 31.250、62.500、 125.000、 250.000 和500.000 mg·L－1，于37 ℃、5% CO2條件下厭氧培養(yǎng)24 h，采用酶標(biāo)儀在波長為600 nm 處測量吸光度（A）值，對照組A（600）值的1/2 所對應(yīng)的濃度即為MIC50。MIC50定義為與空白對照組相比至少抑制50%細(xì)菌生長的最低藥物濃度。

1.4 棋盤微量稀釋法通過棋盤微量稀釋法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，檢測G-Rh2 和NaF 間是否具有協(xié)同抑制變異鏈球菌的作用。將100 μL 菌液依次加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的2～6 行和2～6 列中分別加入50 μL 不同濃度的G-Rh2和NaF， G-Rh2 的 最 終 濃 度 為3.125、 3.750、5.000、6.250 和7.510 mg·L－1，NaF 的 最 終 濃 度為3.90625、7.81250、15.62500、31.25000、62.50000 和125.00000 mg·L－1，菌液最終濃度為1×106CFU·mL－1，空白對照組內(nèi)不含任何藥物。各組混勻后厭氧培養(yǎng)24 h， 采用酶標(biāo)儀檢測A （600）值以觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥時(shí)的結(jié)果計(jì)算分級抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)，定量檢測2 種藥物之間是否具有協(xié)同作用。FIC 的計(jì)算公式：FIC=聯(lián)合用藥時(shí)A 藥的MIC50值/單獨(dú)應(yīng)用A 藥時(shí)的MIC50值+聯(lián)合應(yīng)用B 藥時(shí)的MIC50值/單獨(dú)應(yīng)用B 藥時(shí)的MIC50值。當(dāng)FIC＜0.5 時(shí)，表示2 種藥物間有協(xié)同作用；當(dāng)FIC 為0.5～1.0 和1.0～2.0 時(shí)分別表示相加作用和無關(guān)作用；當(dāng)FIC＞2.0 表示2 種藥物間有拮抗作用。

1.5 生物膜形成量的測定采用結(jié)晶紫染色法定量檢測G-Rh2 與NaF 單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)變異鏈球菌生物膜的形成量，并檢測藥物半數(shù)最小生物膜抑制 濃 度 （half minimum biofilm inhibition concentration，MBIC50）。將等量的菌液和不同濃度的藥物分別加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，G-Rh2 最終 濃 度： 15.0、 20.0、 22.5、 25.0、 30.0 和40.0 mg·L－1；NaF 最 終 濃 度：15.625、31.250、62.500、 125.000、 250.000 和500.000 mg·L－1；檢測G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生物膜形成量的影響時(shí)分組為MBIC50G-Rh2 組、MBIC50NaF 組 和MBIC50G-Rh2+MBIC50NaF 聯(lián) 合組；空白對照組內(nèi)不含任何藥物。各組厭氧培養(yǎng)24 h 后吸出每孔中的液體，戊二醛固定，結(jié)晶紫染色，最后溶于95%酒精中，用酶標(biāo)儀測定600 nm波長處的A值，定量檢測MBIC50，對照組A（600）值的1/2 所對應(yīng)的濃度即為MBIC50。MBIC50定義為與空白對照組相比至少抑制50%細(xì)菌生物膜形成時(shí)的最低藥物濃度。

1.6 變異鏈球菌生長曲線的繪制分別將等量的菌液和不同分組的藥物加入離心管中，藥物分組為MIC50G-Rh2 組、 MIC50NaF 組 和MIC50G-Rh2+MIC50NaF 聯(lián)合組，空白對照組內(nèi)不含任何藥物。各組混勻后置于厭氧環(huán)境中培養(yǎng)，每隔4 h 采用酶標(biāo)儀測量A （600） 值，并繪制生長曲線，觀察G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對變異鏈球菌生長變化的影響。

1.7 產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)檢測G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對變異鏈球菌的產(chǎn)酸抑制率分別將等量的菌液和不同分組的藥物加入離心管中，藥物分組為MIC50G-Rh2 組、 MIC50NaF 組 和MIC50G-Rh2+MIC50NaF 聯(lián)合組，空白對照組內(nèi)不含任何藥物。調(diào)整各管內(nèi)初始pH 值，即pH0均為7.4，厭氧培養(yǎng)24 h 后取上清液，依次測量pH 值，記為pH1。計(jì)算pH 值的變化即ΔpH，ΔpH=pH0－pH1，并計(jì)算產(chǎn)酸抑制率，空白對照組產(chǎn)酸抑制率為0。產(chǎn)酸抑制率=（對照組ΔpH－實(shí)驗(yàn)組ΔpH）/對照組ΔpH×100%。ΔpH 值越小，產(chǎn)酸抑制率越高，表明抑制細(xì)菌產(chǎn)酸的作用越強(qiáng)。

1.8 掃描電鏡觀察各組變異鏈球菌形態(tài)、數(shù)量和生物膜結(jié)構(gòu)將細(xì)胞爬片置于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔分別加入等量的菌液和不同分組的藥物，藥物分 組 為 MBIC50G-Rh2 組、 MBIC50NaF 組 和MBIC50G-Rh2+MBIC50NaF 聯(lián)合組，于厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后吸出每孔中的液體，戊二醛固定、酒精梯度脫水、干燥、樣本鍍金，掃描電鏡下觀察變異鏈球菌形態(tài)、數(shù)量和生物膜結(jié)構(gòu)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組生物膜形成量和ΔpH 值符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微量稀釋法檢測不同濃度G-Rh2 和NaF 對變異鏈球菌的MIC50值隨著濃度的升高，G-Rh2 和NaF 對變異鏈球菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)G-Rh2濃度為25.0 mg·L－1，NaF 濃度為125.000 mg·L－1時(shí)可以抑制空白對照組50% 細(xì)菌的增長（P＜0.05），因 此G-Rh2 的MIC50值 為25.0 mg·L－1，NaF 的MIC50值為125.000 mg·L－1。見圖1。

圖1 不同濃度G-Rh2 和NaF 對變異鏈球菌生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of different concentrations of G-Rh2 and NaF on growth of Streptococcus mutans

2.2 G-Rh2 和NaF 聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌的抑制作用當(dāng)G-Rh2 與NaF 單 獨(dú) 應(yīng) 用 時(shí)，G-Rh2 的MIC50值 為 25.0 mg·L－1， NaF 的 MIC50值 為125.000 mg·L－1，而當(dāng)G-Rh2 與NaF 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，G-Rh2 的MIC50值僅為5.00 mg·L－1，NaF 的MIC50值僅為31.25 mg·L－1，F(xiàn)IC=0.45，小于0.50，表明G-Rh2 與NaF 具有協(xié)同抑制變異鏈球菌的作用。

2.3 結(jié)晶紫染色法檢測G-Rh2 和NaF 對變異鏈球菌的MBIC50值當(dāng)G-Rh2 濃度為15.0 mg·L－1時(shí)可以抑制變異鏈球菌生物膜的形成，隨著濃度的升高，抑制作用越強(qiáng)，生物膜的形成量越少，且G-Rh2 的MBIC50值為22.5 mg·L－1（P＜0.05）；NaF可以減少變異鏈球菌生物膜的形成量，且濃度越大生物膜的形成量越少，當(dāng)NaF 濃度為62.5 mg·L－1時(shí)，變異鏈球菌生物膜形成量僅為空白對照組的1/2，因此NaF 的MBIC50值為62.500 mg·L－1（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度G-Rh2 和NaF 對變異鏈球菌生物膜的MBIC50值Fig.2 MBIC50 of Streptococcus mutans biofilm when treated with different concentrations of G-Rh2 and NaF

2.4 結(jié)晶紫染色法檢測G-Rh2 和NaF 聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生物膜的抑制作用本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與單組藥物組和空白對照組比較，聯(lián)合應(yīng)用組A （600）值降低，見表1。結(jié)晶紫染色檢測結(jié)果顯示空白對照組生物膜較厚，著色較深；與空白對照組比較，MBIC50G-Rh2 組和MBIC50NaF 組變異鏈球菌生物膜形成受到抑制，生物膜著色相對較淺，而MBIC50G-Rh2+MBIC50NaF 聯(lián)合組生物膜幾乎不能著色，生物膜形成量明顯減少并少于單獨(dú)應(yīng)用單組藥物時(shí)。見圖3。

圖3 結(jié)晶紫染色分析G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用時(shí)變異鏈球菌生物膜形成量Fig. 3 Biofilm formation amounts of Streptococcus mutans when treated with G-Rh2 and NaF alone or in combination analyzed by crystal violet staining

表1 G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生物膜的抑制作用Tab. 1 Inhibitory effects of G-Rh2 and NaF alone or in combination on Streptococcus mutans biofilm (n=3,±s)

表1 G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生物膜的抑制作用Tab. 1 Inhibitory effects of G-Rh2 and NaF alone or in combination on Streptococcus mutans biofilm (n=3,±s)

*P＜0.01 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with MBIC50G-Rh2 group；#P＜0.01 compared with MBIC50NaF group.

Group A(600)Blank control 3.298±0.0368 MBIC50G-Rh21.657±0.0321*MBIC50NaF 1.616±0.0326*MBIC50G-Rh2+MBIC50NaF combined 0.602±0.0440*△#

2.5 G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用時(shí)變異鏈球菌的生長曲線生長曲線圖可見空白對照組的變異鏈球菌在0～12 h 內(nèi)生長迅速，之后生長逐步緩慢，最后進(jìn)入穩(wěn)定期。與空白對照組比較，單獨(dú)應(yīng)用G-Rh2 或NaF 時(shí)變異鏈球菌的生長速度均降低（P＜0.05），而聯(lián)合應(yīng)用G-Rh2 與NaF 時(shí)變異鏈球菌的生長速度明顯降低，且低于單獨(dú)藥物組（P＜0.05），表明2 種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對變異鏈球菌的抑制作用更優(yōu)。見圖4。

圖4 G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用時(shí)變異鏈球菌生長曲線Fig. 4 Growth curves of Streptococcus mutans when treated with G-Rh2 and NaF alone or in combination

2.6 各組ΔpH 值和產(chǎn)酸抑制率空白對照組、MIC50G-Rh2 組、 MIC50NaF 組 和MIC50G-Rh2+MIC50NaF 聯(lián) 合 組 ΔpH 值 為 2.627±0.048、1.457±0.026、 1.393±0.035 和 0.433±0.049。與空白對照組比較，MIC50G-Rh2 組、MIC50NaF 組和MIC50G-Rh2+MIC50NaF 聯(lián)合組的ΔpH 值均降低，且MIC50G-Rh2+MIC50NaF 聯(lián)合組ΔpH 值低于MIC50G-Rh2 組和MIC50NaF 組。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果由產(chǎn)酸抑制率計(jì)算公式可得，24 h 內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用G-Rh2 或NaF 的產(chǎn)酸抑制率分別為44.54%和47.00%，而聯(lián)合應(yīng)用G-Rh2 與NaF 時(shí)產(chǎn)酸抑制率高達(dá)83.51%。

2.7 掃描電鏡下變異鏈球菌形態(tài)空白對照組變異鏈球菌的生物膜較厚，細(xì)菌之間緊密連接，形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，并由致密的胞外基質(zhì)包繞成三維立體結(jié)構(gòu)；MIC50G-Rh2 組和MIC50NaF 組可見生物膜厚度降低，胞外基質(zhì)量減少，細(xì)菌之間排列疏松；而MIC50G-Rh2+MIC50NaF 聯(lián)合組生物膜結(jié)構(gòu)消失，細(xì)菌數(shù)量減少且細(xì)菌形態(tài)發(fā)生變化，可見細(xì)菌表面較粗糙，有凹坑狀結(jié)構(gòu)存在。見圖5。

圖5 G-Rh2 和NaF 單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用時(shí)變異鏈球菌掃描電子顯微鏡圖像（×20000）Fig. 5 Scanning electron microscope images of Streptococcus mutans when treated with G-Rh2 and NaF alone or in combination（×20000）

3 討論

氟化物作為一種常用的防齲物質(zhì)，使用不當(dāng)會出現(xiàn)耐氟菌株、氟牙癥和氟骨癥等不良反應(yīng)［10］，短期內(nèi)氟化物抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸的能力可隨時(shí)間的推遲而減弱［11］，因此許多學(xué)者提出將氟化物與其他藥物聯(lián)合使用，以達(dá)到降低氟化物用量、彌補(bǔ)氟化物不足和增強(qiáng)防齲效果的目的［12］。人參皂苷具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和提高機(jī)體抗感染能力等功能，其不僅可以抑制細(xì)菌生長還可以增強(qiáng)其他藥物的抑菌性能［13-14］。因此本研究將G-Rh2 與NaF 聯(lián)合應(yīng)用，以期通過2 種藥物間潛在的協(xié)同作用來降低單組藥物的用量。

變異鏈球菌是公認(rèn)的主要致齲菌，其可以利用葡糖基轉(zhuǎn)移酶代謝蔗糖產(chǎn)生胞外多糖，從而有利于細(xì)菌黏附和生物膜形成［15］，還可以利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸等多種有機(jī)酸，使菌斑pH 值始終處于臨界pH 值（5.5）之下，且變異鏈球菌具有較強(qiáng)的耐酸性，在酸性環(huán)境中可通過改變自身基因表達(dá)來提高生存能力，使其在牙菌斑致齲過程中發(fā)揮重要作用［16］，因此減弱變異鏈球菌的黏附性、產(chǎn)酸性和耐酸性等致齲毒力因素是防齲的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用G-Rh2 與NaF 可以抑制變異鏈球菌生長、生物膜形成和產(chǎn)酸，且較單組藥物應(yīng)用時(shí)效果更好。棋盤微量稀釋法檢測結(jié)果顯示：僅將5.0 mg·L－1G-Rh2 與31.250 mg·L－1NaF 聯(lián)合應(yīng)用就可以達(dá)到單獨(dú)應(yīng)用25.0 mg·L－1G-Rh2 或125.000 mg·L－1NaF 的效果；生 長曲線表明：與空白對照組和單組藥物組比較，聯(lián)合組對細(xì)菌生長的抑制作用更明顯；結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)和掃描電鏡檢測結(jié)果顯示：聯(lián)合組較單獨(dú)藥物組更能抑制變異鏈球菌生物膜的形成，且聯(lián)合組的產(chǎn)酸抑制率高于空白對照組和單獨(dú)藥物組，表明聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能更好地抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸。關(guān)于G-Rh2 和NaF抑制變異鏈球菌的相關(guān)機(jī)制，2 種藥物均可通過降低變異鏈球菌胞外多糖水平，抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶和烯醇酶等糖酵解相關(guān)酶的活性等來影響生物膜形成和產(chǎn)酸［17-18］。除上述共同抑菌途徑之外，NaF 還可抑制胞內(nèi)多糖生長及抑制過氧化物酶和過氧化氫酶活性來影響變異鏈球菌生長及生物膜形成，且其能抑制F－ATPase 和H+ATPase 等質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)酶的活性使細(xì)胞質(zhì)酸化，降低變異鏈球菌的耐酸性［19-21］，而G-Rh2 可以直接破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、抑制磷酸轉(zhuǎn)移酶和乙醛/乙醇脫氫酶等的活性、影響群體感應(yīng)系統(tǒng)及抑制eDNA 釋放［22］，此外還可通過消除質(zhì)粒和抑制β-內(nèi)酰胺酶活性等途徑來干預(yù)及逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性［23］。

綜上所述，將G-Rh2 與NaF 聯(lián)合應(yīng)用不僅可通過共同的抑菌途徑發(fā)揮作用，還可通過各自的抑菌機(jī)制增強(qiáng)效果，降低變異鏈球菌耐藥性的發(fā)生，但2 種藥物協(xié)同抑制變異鏈球菌的具體機(jī)制，仍需要進(jìn)一步的探討研究。