趙智慧, 白香花, 何金玲, 段偉琴, 劉 敏, 張生茂

（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017）

隨著心臟介入等各種手術(shù)治療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得心血管疾病治療得到改善，但同時(shí)也造成心肌缺血再灌注損傷 （myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）。MIRI 是指缺血的心肌在恢復(fù)供血后，不僅心肌功能不能得到恢復(fù)，反而會(huì)造成心肌損傷加重，出現(xiàn)心律失常、心肌梗死和心臟舒縮功能障礙等現(xiàn)象［1］。MIRI 發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，研究［2］表明：細(xì)胞凋亡是介導(dǎo)MIRI 的重要因素，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來減輕心肌細(xì)胞凋亡，可減輕MIRI，起到保護(hù)心肌的目的。舒芬太尼是一種阿片受體激動(dòng)劑，對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，可改善MIRI 造成的心肌損傷［3-4］。長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA， LncRNA） 在調(diào)控細(xì)胞分子功能方面的作用越來越受到關(guān)注，其在心血管疾病、腫瘤及代謝性疾病中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，并已經(jīng)成為MIRI 治療的新靶點(diǎn)［5］。LncRNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（metastasis-associated lung adnecarcinoma transcript 1，MALAT1） 廣 泛地表達(dá)于哺乳動(dòng)物的正常組織和器官，對心肌損傷性疾病在內(nèi)的多種疾病具有調(diào)控作用。本課題組前期研究［6］顯示：舒芬太尼預(yù)處理可通過抑制LncRNA-MALAT1 延緩大鼠MIRI 進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制未進(jìn)行深入探討。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激 酶（extracellular signal-modulating kinase 1/2，ERK1/2） 信號通路在MIRI 后心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。研究［7-8］表明：ERK1/2 信號通路的激活與MIRI 后處理及預(yù)處理的心肌保護(hù)效應(yīng)有密切的關(guān)聯(lián)，具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，并且LncRNA-MALAT1 可直接靶向調(diào)控ERK1/2 信號通路的活性。但舒芬太尼是否能夠通過調(diào)控LncRNA-MALAT1 影響ERK1/2 信號通路活性來抑制大鼠MIRI 心肌細(xì)胞凋亡，尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用MIRI 體內(nèi)外模型，從LncRNAMALAT1 與ERK1/2 信號通路角度探討舒芬太尼對大鼠MIRI 心肌細(xì)胞凋亡的影響，并闡明其作用機(jī)制，為臨床防治MIRI 提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器SPF 級雄性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（200±10）g，購于遼寧長生生物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2019-0001。H9C2 細(xì)胞購自美國ATCC 公司。舒芬太尼購于宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，原位雜交試劑盒和寡核苷酸探針購于武漢博士德生物科技有限公司，TUNEL 試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，兔抗GAPDH 抗體購于美國Cell Signaling Technology（CST）公司，兔抗半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine protease protein-3， caspase-3）、活化半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved cysteine protease protein-3，cleaved-caspase-3）、 B 細(xì) 胞 淋 巴 瘤 2 （B cell lymphoma-2， Bcl-2）、 Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein， Bax）、 ERK1/2 和 磷 酸 化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）抗體購于英國Abcam 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗購于北京博奧森生物科技有限公司，MALAT1 腺相關(guān)病毒（cDNA-MALAT1）及MALAT1 過表達(dá)載體（pcDNA-MALAT1） 購于上海吉瑪生物科技有限公司，全蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒購于北京碧云天生物有限公司，RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于加拿大Fermentas 公司，TransStart Top Green qPCR SuperMix 購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000試劑盒購于美國Life Technologies 公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Ⅸ-51 型倒置熒光顯微鏡（日本奧林帕斯公司），RM2135 型石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司），MR96A 型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞公司），CHEFMapperXA 型水平核酸電泳儀和半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司），Midi40 型恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司），7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（美國ABI 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和大鼠MIRI 模型制備30 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和舒芬太尼組，每組10 只。參照文獻(xiàn)［6］的方法建立大鼠MIRI 模型，大鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，隨后四肢插入電極針記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管切開后接呼吸機(jī)，潮氣量2.5 mL，呼吸頻率70～80 min。開胸后用手術(shù)線在距離左冠狀動(dòng)脈前降支（left anterior descending coronary artery， LAD） 根 部4 mm 處結(jié)扎，持續(xù)30 min，解開手術(shù)線，再灌注維持120 min，以心電圖ST 段弓背向上抬高，結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色蒼白作為心肌缺血的標(biāo)志，釋放后最初蒼白區(qū)域的充血反應(yīng)為再灌注成功的標(biāo)志。假手術(shù)組大鼠只開胸不結(jié)扎，舒芬太尼組大鼠于再灌注前10 min 于尾靜脈注射舒芬太尼1 μg·kg－1，假手術(shù)組和模型組大鼠注射等體積生理鹽水。所有大鼠在完成再灌注2 h 后處死。

1.3 RT-qPCR 法檢測各組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 mRNA 表達(dá)水平利用Trizol法提取大鼠心肌組織總RNA，并按照試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)總體積為20 μL；逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。取2 μL cDNA 模 板，按 照RT-qPCR 擴(kuò) 增 說 明 書 進(jìn) 行體外擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、1 min。以U6 作為內(nèi)參，LncRNA-MALAT1 上 游 引 物 序 列： 5′-GAGCGAGTGCAATTTGGTGATG-3′，下游引物序列：5′-ATCCTCTACGCACAACGCC-3′；U6 上 游 引物 序 列： 5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，下 游 引 物 序 列： 5′-TTTGATGTCACGCACGATTT-3′， 采 用2-△△Ct法 計(jì) 算 目 的LncRNAMALAT1 mRNA 表達(dá)水平。

1.4 熒光探針原位雜交（fluorescencein situby hybridization，F(xiàn)ISH）法檢測各組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 表達(dá)水平心肌組織取出洗凈后立即放入固定液中固定12 h 以上。組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟、包埋。石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，60 ℃烤箱烤片2 h。依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min→二甲苯Ⅱ15 min→無水乙醇Ⅰ5 min→無水乙醇Ⅱ5 min 進(jìn)行脫水，DEPC 水浸泡。根據(jù)組織固定時(shí)間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10 min，自然冷卻。根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K（20 mg·L－1）37 ℃消化20 min，純水沖洗后PBS 緩沖液洗5 min×3 次，滴加預(yù)雜交液，37 ℃孵育1 h；傾去預(yù)雜交液，滴加含探針MYLK-AS1 probe 雜交液，濃度8 μg·L－1，恒溫箱37 ℃雜交過夜；切片滴加DAPI 染液，避光孵育8 min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片，切片于波長熒光顯微鏡（激發(fā)波長460～550 nm，發(fā)射波長590 nm）下觀察并采集圖像并拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析，以積分光密度（integral optical density，IOD）值表示大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 表達(dá)水平。

1.5 原位末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick and labeling，TUNEL）法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL 染色，顯微鏡觀察并拍照，利用Image J 軟件對照片中陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI 陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 H9C2 細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型制備將H9C2細(xì)胞按照每毫升1×106個(gè)的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為對照組、模型組、舒芬太尼組、pcDNA-MALAT1 組（MALAT1 組） 和 舒 芬 太尼+pcDNA-MALAT1 組（舒芬太尼+MALAT1組）。H9C2 細(xì)胞融合度大于80%時(shí)，將培養(yǎng)液更換為無菌PBS 緩沖液，在缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱（95%N2+5% CO2） 中孵育10 h，隨后復(fù)氧（95% O2-5% CO2），將無菌PBS 緩沖液重新更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 舒芬太尼組、 舒芬太尼+MALAT1 組 先 用10 μmol·L－1舒 芬 太 尼 孵 育2 h，隨后制備缺氧復(fù)氧損傷模型。MALAT1 組、舒芬太尼+MALAT1 組首先轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT1，24 h 后進(jìn)行舒芬太尼預(yù)處理，再制備缺氧復(fù)氧損傷模型。

1.7 Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織和H9C2 細(xì)胞中caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、ERK1/2 及p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平提取心肌組織和H9C2 細(xì)胞全蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量分析，加上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，變性蛋白，隨后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉(zhuǎn)膜、封閉。caspase-3、cleaved-caspase-3、 Bax、 Bcl-2、 ERK1/2、p-ERK1/2 和GAPDH 抗 體（1∶1000） 進(jìn) 行 孵育，放入濕盒中，4 ℃過夜；次日，TBST 洗膜，室 溫 孵 育HRP 標(biāo) 記 二 抗（1∶1000） 1.5 h，TBST 洗膜，ECL 顯色液顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠心肌組織和H9C2 細(xì)胞中LncRNA-MALAT1 表達(dá)水平，心肌細(xì)胞凋亡率，心肌組織和H9C2 細(xì)胞中caspase-3、 cleavedcaspase-3、Bax/Bcl-2、ERK1/2 和p-ERK1/2 蛋 白表達(dá)水平經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 mRNA 表達(dá)水平與假手術(shù)組（0.311±0.09）比較，模型組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 mRNA 表達(dá)水平（0.789±0.124）明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，舒芬太尼組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 mRNA 表達(dá)水平（0.473±0.109）明顯降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 表達(dá)率與假手術(shù)組（0.32%±0.04%）比較，模型組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 表達(dá)率（0.78%±0.11%）明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，舒芬太尼組大鼠心肌組織中LncRNAMALAT1 表 達(dá) 率（0.51%±0.10%） 明 顯 降 低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 FISH 法檢測各組大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 表達(dá)情況（×400）Fig.1 Expressions of LncRNA-MALAT1 in myocardium tissue of rats in various groups detected by FISH(×400)

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率與假手術(shù)組（2.53%±0.26%）比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（27.58%±4.35%） 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，舒芬太尼組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（15.90%±2.51%） 明 顯 降 低 （P＜0.05）。見圖2。

圖2 TUNEL 法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(×400)Fig.2 Apoptosis of cardiomyocytes in various groups detected by TUNEL method(×400)

2.4 各組大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2 比值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，舒芬太尼組大鼠心肌組織中cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2 比值明顯降低（P＜0.05）；各組大鼠心肌組織中caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖3。

圖3 Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 3 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of apoptosis-related proteins in myocardial tissue of rats detected by Western blotting method

2.5 各組大鼠心肌組織中ERK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，舒芬太尼組大鼠心肌組織中p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；各組大鼠心肌組織中ERK1/2 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織中ERK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 4 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in myocardium tissue of rats detected by Western blotting method

2.6 各組H9C2 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組H9C2 細(xì)胞中cleavedcaspase-3 蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2 比值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，舒芬太尼組H9C2 細(xì)胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值明顯降低（P＜0.05）；與MALAT1 組比較，舒芬太尼+MALAT1 組H9C2 細(xì)胞中cleavedcaspase-3 蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2 比值明顯降低（P＜0.05）；各組H9C2 細(xì)胞中caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting 法檢測各組H9C2 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 5 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of apoptosis-related proteins in HPC2 cells in various group detected by Western blotting method

2.7 各 組H9C2 細(xì) 胞中ERK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組H9C2 細(xì)胞中p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，舒芬太尼組H9C2 細(xì)胞中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與MALAT1組比較，舒芬太尼+MALAT1 組H9C2 細(xì)胞中p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；各組H9C2 細(xì)胞中ERK1/2 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 Western blotting 法檢測各組H9C2 細(xì)胞中ERK1/2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in HPC2 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討論

MIRI 是指在缺血期間心肌細(xì)胞的可逆損傷，在恢復(fù)血液供應(yīng)后變成不可逆損傷。本研究參照文獻(xiàn)［9］，通過結(jié)扎LAD 的方法建立大鼠MIRI 模型，具有操作簡便、成功率高和模型可靠等特點(diǎn)。臨床上，MIRI 屬于較常見的心肌疾病，所涉及的機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為再灌注時(shí)氧自由基增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷、心肌細(xì)胞凋亡及壞死和炎癥反應(yīng)等是MIRI 病理生理過程進(jìn)展的重要因素［1-2］。MIRI 發(fā)展過程中伴隨著基因表達(dá)的改變，研究［10-17］表明：非編碼RNA 與心肌功能調(diào)節(jié)關(guān)系密切。非編碼RNA 不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，LncRNA 是一類長度大于200 個(gè)核苷酸單位的非編碼RNA，由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄合成，經(jīng)RNA 剪切并經(jīng)3′UTR 端修飾，不參與蛋白質(zhì)的編碼過程，然而研究［5-6］表明其在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞增殖與分化等方面發(fā)揮著重要作用。LncRNA在MIRI 發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著重要角色，KONG 等［10］發(fā) 現(xiàn)：LncRNA RMRP 上 調(diào) 通 過 吸 附miR-206 靶 向ATG3 表 達(dá) 而 加 重MIRI。MA 等［11］報(bào)道了LncRNA 富含轉(zhuǎn)錄本1 可通過自噬通量阻滯和凋亡抑制鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠MIRI。HU 等［12］發(fā) 現(xiàn)：LncRNA OPRM1 過 表 達(dá)可通過調(diào)節(jié)OPRM1/miR-30b-5p/CSE 軸活性來增加內(nèi)源性硫化氫，從而減輕大鼠MIRI。LncRNAMALAT1 最早發(fā)現(xiàn)于非小細(xì)胞肺癌中，其與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，LncRNA MALAT1在心血管系統(tǒng)疾病中亦具有調(diào)控作用［13］。RUAN 等［13］發(fā) 現(xiàn)： 在 MIRI 大 鼠 模 型 中，LncRNA-MALAT1 高表達(dá)， 其可通過靶向miR-26b 調(diào)節(jié)Ptgs2，從而加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)MIRI 進(jìn) 展。 XU 等［7］研 究 發(fā) 現(xiàn)： LncRNAMALAT1 可通過介導(dǎo)β-catenin 信號通路促進(jìn)MIRI大 鼠 心 肌 細(xì) 胞 凋 亡。 ZHAO 等［14］研 究 發(fā) 現(xiàn)：LncRNA-MALAT1 通過負(fù)性調(diào)節(jié)miR-145/Bnip3途徑消除芬太尼對MIRI 小鼠模型的心臟保護(hù)作用。SUN 等［15］研究發(fā)現(xiàn)：MALAT1基因敲除可顯著改善I/R 誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷并促進(jìn)心功能，其機(jī)制可能與MALAT1 siRNA 激活A(yù)KT 信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，MIRI 大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 表達(dá)水平明顯升高，而經(jīng)舒芬太尼處理后可明顯降低MIRI 大鼠心肌組織中LncRNA-MALAT1 表達(dá)水平，與本課題組前期研究［6］結(jié)果一致。

MIRI 可引起心肌細(xì)胞凋亡，且MIRI 導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是心肌損傷的重要因素之一［18］。Bcl-2家族分為抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白：其中Bax 是一種重要的促凋亡蛋白，其可改變線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素C 和凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosisinducing factor， AIF），激活線粒體凋亡通路，并可下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，抑制其生理功能；Bcl-2 是機(jī)體重要的抑制凋亡蛋白，主要通過改變線粒體的膜通透性，阻止線粒體內(nèi)的凋亡分子細(xì)胞色素C 和AIF 的釋放，抑制caspase-3 活性，從而抑制細(xì)胞凋亡［19］；當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號時(shí)，線粒體的膜通透性增加，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C 和AIF 等促凋亡因子釋放入細(xì)胞漿， 并與凋亡酶激活因子-1（apoptotic enzyme activator-1，Apaf-1）和caspase-9結(jié)合形成復(fù)合物，從而激活下游caspase-3 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，MIRI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2 比值明顯升高；而給予舒芬太尼干預(yù)后MIRI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、促凋亡蛋白cleaved-caspase-3 和Bax/Bcl-2 比值明顯降低，可能是抑制了線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，抑制caspase-3 活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。提示舒芬太尼對MIRI 大鼠的保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

ERK1/2 信號通路是絲裂原活性蛋白激酶（MAPK）信號通路的亞家族之一，與機(jī)體細(xì)胞增殖與分化關(guān)系密切。ERK1/2 信號通路具有明確的心肌保護(hù)作用，ERK1/2 信號通路激活可顯著增強(qiáng)大鼠心肌細(xì)胞抗凋亡的能力，可明顯減輕大鼠MIRI 損傷。孟慶莉等［21］研究發(fā)現(xiàn)：柿葉提取物可通過激活ERK1/2 信號通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕大鼠MIRI。本研究結(jié)果表明： 模型組大鼠p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平明顯降低，ERK1/2 信號通路活性被抑制，而給予舒芬太尼后p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯升高，ERK1/2 信號通路被激活，表明舒芬太尼對MIRI 大鼠的保護(hù)作用機(jī)制可能與激活ERK1/2 信號通路有關(guān)。

研 究［22］表 明：LncRNA-MALAT1 可 通 過 直接靶向ERK1/2 信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能。因此本研究推測舒芬太尼是通過抑制LncRNA-MALAT1表達(dá)，從而激活ERK1/2 信號通路，發(fā)揮抗凋亡作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此機(jī)制， 本研究參照文獻(xiàn)［23］的方法制備大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，用以模擬在體MIRI 過程，并轉(zhuǎn)染MALAT1過表達(dá)載體使MALAT1 高表達(dá)，觀察舒芬太尼對H9C2 細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示：MALAT1 過表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)H/R 細(xì)胞凋亡，并且進(jìn)一步抑制ERK1/2 信號通路的活性；而給予舒芬太尼可明顯逆轉(zhuǎn)MALAT1 過表達(dá)誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 比值升高；并且舒芬太尼逆轉(zhuǎn)了MALAT1 過表達(dá)導(dǎo)致的H9C2 細(xì)胞ERK1/2 信號通路被抑制的現(xiàn)象。以上結(jié)果提示：舒芬太尼是通過抑制LncRNA-MALAT1，靶向激活ERK1/2 信號通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)MIRI 的作用。

MIRI 的作用機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)LncRNA 和信號通路的變化，本研究只對LncRNA-MALAT1和ERK1/2 信號通路進(jìn)行了初步探討，深入研究舒芬太尼對其他MIRI 靶點(diǎn)的影響，對明確其保護(hù)MIRI 的作用機(jī)制至關(guān)重要。

綜上所述，舒芬太尼減輕MIRI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡可能與抑制LncRNA-MALAT1 表達(dá)從而激活ERK1/2 信號通路有關(guān)。