陳素賢, 谷澤慧, 馬煬斐, 譚 琦, 李 琪, 王亞帝

（1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科,遼寧 錦州 120001；2. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院精準醫(yī)學(xué)中心,遼寧 錦州 120001）

結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床上常見的消化道惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，CRC是男性中第3 位和女性中第2 位最常被診斷出的癌癥［1］，在 我 國 是CRC 發(fā) 病 率 第3 位 的 癌 癥［2］。盡管CRC 的早期診斷和治療手段有很大改善，但其5年生存率較低，治療效果不佳?，F(xiàn)行的腫瘤藥物不良反應(yīng)較多，常見骨髓抑制和過敏反應(yīng)等。因此，尋找不良反應(yīng)少、質(zhì)優(yōu)價廉的藥物至關(guān)重要。研究［3-4］顯示：天然黃酮類衍生物具有抗腫瘤作用，且平價易得，而蘆丁是廣泛存在于植物中的黃酮醇配糖體，具有抗炎、抗氧化和清除自由基等多種藥理作用，同時具有抗腫瘤作用［5］。蘆丁可以明顯抑制SW480 細胞的增殖，對CRC 的進一步發(fā)展起到很好的延緩作用，但蘆丁對CRC 的具體作用機制尚不明確，Notch 是結(jié)腸癌中常發(fā)生突變的基因之一，Notch 在腫瘤中具有致癌特性，更清楚地了解Notch 信號傳導(dǎo)及其在結(jié)腸癌中的作用可能是發(fā)現(xiàn)臨床靶標的關(guān)鍵。Notch 信號通路是許多重要細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。單獨的Notch 蛋白并不足以成為有效的致癌基因，必須與其他癌蛋白協(xié)作才能導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化，可與其下游絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK） 協(xié)作共同推進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。蘆丁抗腫瘤作用機制目前尚不清楚，其在CRC 中的抑瘤作用是否與Notch 和MAPK通路有關(guān)，目前尚未見相關(guān)報道。本研究探討蘆丁作用下CRC 細胞中Notch-1 的表達、促凋亡作用及其可能的分子機制，為CRC 的靶向治療提供新的思路和藥物基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫篩選毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）和GeneCards 數(shù)據(jù)庫篩選蘆丁相關(guān)mRNA，使用在線韋恩圖制作軟件對預(yù)測的與蘆丁相關(guān)mRNA 取交集用于進一步分析?；虮倔w（Gene Ontology，GO） 和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對交集mRNA 進行生物信息學(xué)分析。String 數(shù)據(jù)庫分析其交集mRNA 表達的蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.2 細胞、主要試劑和儀器人CRC SW480 細胞株（吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)實驗室饋贈）。蘆?。暇┚爸裆锟萍加邢薰荆?，γ-分泌酶抑制劑DAPT 和兔抗人Notch-1 抗體（英國Abcam 公司），兔抗人B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase） -3和caspase-9 一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），Notch-1 和GAPDH 引物（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司），實時熒光定量PCR 試劑盒（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）（北京全式金生物技術(shù)有限公司），Hoechst33258 染色液和Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）。Strata Gene Mx3000P 熒光實時定量分析系統(tǒng)（美國Agilent Technologies 公司），mini-protean 小垂直板電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad Laboratories 公司），SpectraMax Plus384 微孔板檢測系統(tǒng)（美國Molecular Devices 公司）， E-CLIPSE 80i 顯微鏡（日本Nikon Instruments 公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SIM 公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)SW480 細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，約2 d 換液1 次，0.25%胰蛋白酶消化，每周傳代2～3 次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 RT-qPCR 和MTT 法檢測藥物最佳濃度取對數(shù)生長期的SW480 細胞，制成1×105mL－1細胞懸液，每孔1 mL 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，分別給 予DAPT（0.1、1 和10 μmol·L－1） 24 h 后，提取細胞中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 進 行RT-qPCR 實 驗， 測 出 相 應(yīng) 的Ct 值。利用2－△△Ct公式計算Notch-1 mRNA 的相對表達水平，以GAPDH 作為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次。取對數(shù)生長期的SW480 細胞，制成1×104mL－1細胞懸液，每孔200 μL 接種于96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，分別加入蘆丁（5、15、45、135 和405 μmol·L－1）和DAPT （1、 2、 4、 8 和10 μmol·L－1） 干 預(yù) 人SW480 細胞，藥物作用24 h 后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 溶液（5 g·L－1）200 μ L，繼 續(xù) 培 養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去MTT 溶液，按照每孔150 μL加入二甲基亞砜（DMSO），置于搖床15 min，使結(jié)晶溶解，置于酶標儀上490 nm 波長處檢測吸光度（A）值，實驗重復(fù)3 次，以A 值代表細胞的增殖活性， 根據(jù)半數(shù)抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）值選出2 種藥物最佳濃度。

1.5 實驗分組蘆丁與DAPT 分別用DMSO 配成1 mol·L－1的儲液，－20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗分為空白對照組（單純培養(yǎng)基）、蘆丁組（22 μmol·L－1）、DAPT 組（1 μ mol·L－1） 和 蘆 丁+DAPT 組（22 μmol·L－1蘆丁+1 μmol·L－1DAPT）。

1.6 Hoechst33258 核染色法檢測細胞凋亡形態(tài)取對數(shù)生長期的SW480 細胞， 制成1×105mL－1細胞懸液，6 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔底部放置蓋玻片（高壓滅菌），使蓋玻片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，按每孔1 mL 細胞懸液接種，使細胞在玻片上生長，每組設(shè)3 個復(fù)孔，細胞貼壁后分組給藥，24 h 后收集細胞，使用Hoechst33258 染色液染色，抗熒光淬滅封片液封片后于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)，并使用Images Advanced 3.2 成像系統(tǒng)采集圖像，實驗重復(fù)3 次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率取對數(shù)生長期的SW480 細胞，制成每毫升1×105個細胞的懸液，每孔1 mL 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，細胞貼壁后分組給藥， 24 h 后收集細胞， 使用Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒，在1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測，實驗重復(fù)3 次。細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.8 Western blotting 法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達水平取對數(shù) 生 長 期 的SW480 細 胞， 制 成5×105mL－1細胞懸液，每孔1 mL 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，細胞貼壁后分組給藥，作用24 h 后收集細胞提取蛋白，檢測蛋白濃度并計算上樣量。進行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶2000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入對應(yīng)的二抗（1∶5000），采用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，采用Image J 軟件對相應(yīng)的蛋白進行定量分析，實驗重復(fù)3 次。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細胞凋亡率、Notch-1 mRNA 和蛋白表達水平以及凋亡相關(guān)蛋白表達水平符合正態(tài)分布且方差齊，以-±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTD 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫中蘆丁的交集mRNACTD 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)與蘆丁相關(guān)的基因174 個，包括31 個miRNA 和143 個mRNA，篩選mRNA 進行后續(xù)分析。GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)與蘆丁相關(guān)mRNA 125 個。將上述2 個數(shù)據(jù)庫中的mRNA 取 交 集， 共 得 到34 個mRNA： AHR、ALB、BAX、BCL2、CASP1、CASP3、CASP8、CASP9、 CAT、 CBR1、 CYP19A1、 CYP1A1、EIF2S1、 ERN1、 GSR、 HMOX1、 IGF1、IGF1R、 IL1B、 IRS1、 JUN、 LEP、 MAPK1、MMP9、 MPO、 NFE2L2、 NOS2、 PARP1、SIRT1、 SLC22A2、 SOD1、 TNF、 VEGFA 和XDH。見圖1。

圖1 CTD 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫中蘆丁的交集mRNA 韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of intersection mRNA in CTD and GeneCards databases

2.2 蘆丁相關(guān)交集mRNA 的GO 和KEGG 通路富集分析對34 個蘆丁相關(guān)交集mRNA 進行GO 功能分析和KEGG 通路富集，將P值設(shè)定為0.05 獲得分析結(jié)果：生物學(xué)進程中主要參與負調(diào)控凋亡過程、缺氧反應(yīng)、巨噬細胞分化、外源性凋亡信號通路、直接凋亡過程和激活MAPK 活動等過程；在細胞組成方面參與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物的形成；在分子功能中與直接蛋白結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等功能相關(guān)；KEGG 信號通路主要富集在癌癥、CRC、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、凋亡和MAPK 等。

2.3 String 數(shù)據(jù)庫檢測Notch-1 與相關(guān)蛋白的作用關(guān)系String 數(shù)據(jù)庫中使用PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，得到具有35 個節(jié)點數(shù)的Notch-1 PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2A。PPI值為1.0e－16。其中與Notch-1 相互作用的蛋白（score＞0.42） 有 16 個， 包 括 AHR、 ALB、CASP3、 CASP8、 HMOX1、 IGF1、 IGF1R、JUN、 LEP、 MAPK1、 MMP9、 NFE2L2、NOS2、SIRT1、TNF 和VEGFA，可參與細胞凋亡、大腸癌、MAPK 信號通路、癌癥的途徑和癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等信號通路。交集的信號通路為MAPK 信號通路及凋亡，見圖2B。提示Notch-1基因可能通過MAPK、細胞凋亡等關(guān)鍵信號調(diào)控CRC 的發(fā)生發(fā)展。

圖2 交集mRNA 與Notch-1 蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Interaction network of intersection mRNA and Notch-1 protein

2.4 DAPT 和蘆丁最佳濃度分別給予0.1、1.0 和10.0 μmol·L－1DAPT 后，與空白對照組比較，不同濃度DAPT 組SW480 細胞中Notch-1 mRNA 表達水平均明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組SW480 細胞中Notch-1 mRNA 表達水平Tab. 1 Expression levels of Notch-1 mRNA of SW480 cells in various groups (n=3,±s)

表1 各組SW480 細胞中Notch-1 mRNA 表達水平Tab. 1 Expression levels of Notch-1 mRNA of SW480 cells in various groups (n=3,±s)

*P＜0.01 compared with blank control group.

Group Blank control DAPT(μmol·L－1)0.11.010.0 Notch-1/GAPDH 1.000±0.0000.693±0.038*0.303±0.071*0.160±0.010*

1、2、4 、8 和10 μmol·L－1DAPT 干預(yù)SW480細胞后，與空白對照組比較，不同濃度DAPT 組細胞增殖活性均降低（P＜0.05），降低幅度隨著DAPT 濃度的升高逐漸增大。見表2。

表2 不同濃度DAPT 作用后各組SW480 細胞增殖活性Tab. 2 Proliferation activities of SW480 cells after treated with different concentrations of DAPT in various groups(n=3,±s)

表2 不同濃度DAPT 作用后各組SW480 細胞增殖活性Tab. 2 Proliferation activities of SW480 cells after treated with different concentrations of DAPT in various groups(n=3,±s)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group.

Group Blank control DAPT(μmol·L－1)124810 Proliferation activity 1.307±0.0311.113±0.081**0.907±0.031**0.820±0.087*0.667±0.021**0.547±0.035**

5、15、45 、135 和405 μmol·L－1蘆 丁 作 用SW480 細胞后，與空白對照組比較，細胞增殖活性均明顯降低（P＜0.05），降低幅度隨著給藥濃度的增加而增大，見表3。利用GraphPad Prism 軟件計算得到蘆丁對SW480 細胞的IC50值為22.34 μmol·L－1，故 將 蘆 丁 的 最 佳 濃 度 設(shè) 定 為22 μmol·L－1。

表3 不同濃度蘆丁作用后各組SW480 細胞增殖活性Tab. 3 Proliferation activities of SW480 cells after treated with different concentrations of rutin in various groups(n=3,±s)

表3 不同濃度蘆丁作用后各組SW480 細胞增殖活性Tab. 3 Proliferation activities of SW480 cells after treated with different concentrations of rutin in various groups(n=3,±s)

*P＜0.05 compared with blank control group.

Group Blank control Rutin(μmol·L－1)51545135405 Proliferation activity 1.178±0.1200.675±0.103*0.648±0.113*0.561±0.086*0.473±0.083*0.280±0.070*

2.5 各組細胞凋亡的形態(tài)表現(xiàn)Hoechst33258 染色后，在熒光顯微鏡下觀察。正常細胞的細胞核呈彌散均勻藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核呈濃染致密，或呈顆粒碎塊狀，顏色發(fā)白發(fā)亮?？瞻讓φ战M細胞核大多呈彌散均勻藍色，而蘆丁組、DAPT 組和蘆丁+DAPT 組細胞核呈現(xiàn)出不同程度發(fā)白發(fā)亮的顆粒碎塊狀，其中蘆丁+DAPT 組細胞核發(fā)白發(fā)亮現(xiàn)象最為明顯。見圖3。

圖3 各組SW480 細胞形態(tài)表現(xiàn)（Hoechst33258,×200）Fig.3 Morphology of SW480 cells in various groups (Hoechst33258,×200）

2.6 各組SW480 細胞凋亡率各組干預(yù)SW480細胞24 h 后細胞凋亡情況：與空白對照組比較，蘆丁組、DAPT 組和蘆丁+DAPT 組細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05）；蘆丁組與DAPT 組細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與蘆丁組和DAPT 組比較，蘆丁+DAPT 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖4 和表4。

表4 各組SW480 細胞細胞凋亡率Tab. 4 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups(n=3,±s)

表4 各組SW480 細胞細胞凋亡率Tab. 4 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups(n=3,±s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with Rutin group；#P＜0.05 compared with DAPT group.

Group Blank control Rutin DAPT Rutin +DAPT Apoptotic rate 05.470±0.630*7.097±0.571*13.567±1.294*△#

圖4 各組SW480 細胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups

2.7 各組SW480 細胞中凋亡相關(guān)分子蛋白表達水平Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，蘆丁組、DAPT 組和蘆丁+DAPT 組SW480 細胞中caspase-3 和caspase-9 表達水平均明顯升高（P＜0.05），Notch-1 蛋白表達水平和Bcl/Bax 比值明顯降低（P＜0.05）；與蘆丁組和DAPT組比較，蘆丁+DAPT 組SW480 細胞中caspase-3和caspase-9 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），Notch 蛋白表達水平和Bcl-2/Bax 比值明顯降低（P＜0.05）。見圖5 和6。

圖5 各組SW480 細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9 和Notch-1 蛋白表達電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax,caspase-3,caspase-9 and Notch-1 proteins in SW480 cells in various groups

3 討論

蘆丁是天然的抗氧化劑，具有抗炎、抗病毒、預(yù)防和治療心腦血管疾病等廣泛的藥理活性［6-7］。近年來有學(xué)者［8］發(fā)現(xiàn)：蘆丁是一種安全的抗癌藥物，具有較少的不良反應(yīng)。研究［9］表明：聯(lián)合中草藥療法可以普遍減輕誘導(dǎo)耐藥性的危害和化療的不良反應(yīng)。本課題組前期研究［10-11］表明：蘆丁聯(lián)合奧沙利鉑可以促進胃癌細胞的凋亡，同時蘆丁也可以抑制CRC 細胞的增殖。在CRC 中蘆丁和水飛薊賓聯(lián)合誘導(dǎo)調(diào)控凋亡和炎癥等途徑相關(guān)基因的表達，較單獨使用更為有效［12］。但蘆丁作用的分子機制目前尚不十分明確，深入了解蘆丁抗腫瘤的分子機制，以期找到精確的診治標靶具有重要的意義。

對蘆丁抗癌機制的研究［13］顯示：MAPK、p53（抑癌基因，蛋白質(zhì)條帶53000）、細胞凋亡以及核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 等不同細胞信號通路均參與了蘆丁的抗癌作用。本課題組通過對蘆丁抗癌相關(guān)作用通路進行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)：CTD 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共存在34 個交集mRNA，之后經(jīng)GO 功能分析和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)：蘆丁的抗癌功能主要是通過介導(dǎo)癌癥、CRC、TNF、細胞凋亡和MAPK 等信號通路實現(xiàn)的。隨后利用String 數(shù)據(jù)庫對交集mRNA 進行PPI 驗證，結(jié)果提示蘆丁可能通過作用MAPK 信號通路進而調(diào)控凋亡通路發(fā)揮其抗腫瘤的作用。本課題組前期研究［14］顯示：蘆丁可抑制胃癌細胞SGC-7901 增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與p38MAPK通路的激活密切相關(guān)。Notch 信號通路已被證明與各種類型的惡性腫瘤有關(guān)，在表達和存活方面參與了包括細胞增殖、細胞黏附、細胞凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在內(nèi)的不同生物學(xué)過程［15-16］。研究［17］證實：Notch 信號通路在CRC 的進展中起著至關(guān)重要的作用，并與CRC 總生存期密切相關(guān)。在CRC中，阻斷Notch 可導(dǎo)致小鼠CRC 細胞轉(zhuǎn)化和分化，抑制腫瘤生長［18］。在以往研究［19-20］中，蘆丁在三陰乳腺癌中的抗癌潛力與Notch 及MAPK 通路密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：Notch-1 通路抑制劑DAPT 及蘆丁均可促進CRC SW480 細胞的凋亡，聯(lián)合使用時細胞凋亡效果更明顯，提示蘆丁可能具有Notch 和MAPK 信號通路雙重抑制作用。單純干預(yù)MAPK 通路介導(dǎo)的靶向治療可以對一些腫瘤生長起到抑制作用，但對具有高Notch 活性的腫瘤細胞，增殖占據(jù)優(yōu)勢。而靶向調(diào)控Notch 信號時，具有高MAPK 活性的腫瘤細胞也出現(xiàn)凋亡，聯(lián)合靶向Notch 和MAPK 可對體內(nèi)CRC 的生長具有明顯的治療作用［21-22］。因此，蘆丁可能通過介導(dǎo)Notch-1 信號調(diào)控下游高活性的MAPK 通路發(fā)揮促進結(jié)腸癌細胞凋亡的作用。

圖6 各組SW480 細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9 和Notch-1 蛋白表達水平Fig.6 Expressions levels of Bcl-2, Bax, caspase-3, caspase-9 and Notch-1 proteins in SW480 cells in various groups

本研究分析蘆丁組、DAPT組和蘆丁+DAPT組SW480 細胞中Bcl-2 與Bax 表達水平結(jié)果顯示：經(jīng)藥物作用后，與對照組比較，其余3 組細胞的Bcl-2/Bax 比值明顯降低，提示蘆丁可上調(diào)Bax 蛋白表達水平及下調(diào)Bcl-2 蛋白表達水平從而起到抗CRC 的作用，再次驗證生物信息學(xué)分析及String 數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果。Bcl-2 基因是凋亡抑制基因，主要通過自身二聚或與蛋白形成二聚體來發(fā)揮細胞凋亡的作用，而Bax 是凋亡促進基因，其通過增強線粒體的通透性，導(dǎo)致細胞色素C 釋放、caspase-9 激活及后續(xù)的其他caspase 家族激活和最終導(dǎo)致細胞凋亡［23］。caspase 家族被激活后，在caspase 前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，隨后在大小亞基之間切割釋放大小亞基，進而形成兩兩組成的有活性的異四聚體。此時caspase-3 在外來蛋白信號的作用下被切割激活［24］，隨后caspase-3 對caspase-9 進行切割并使之激活，caspase-9 作為直接凋亡效應(yīng)分子具有抑制癌癥的作 用［25］。最 終，caspase-9 通 過 對caspase 靶 蛋 白 的水解，導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡。本研究各處理組中caspase-3 和caspase-9 蛋白表達水平均升高，提示二者與蘆丁和Notch 信號通路加速CRC 細胞凋亡密切相關(guān)。

綜上所述，生物信息學(xué)分析和本研究結(jié)果均表明：蘆丁通過靶向Notch1 可加速CRC 細胞凋亡，且與Notch-1/MAPK 通路的下游凋亡蛋白密切相關(guān)。但蘆丁是直接或間接通過Notch-1 調(diào)控下游的MAPK 信號通路發(fā)揮其抗腫瘤的作用目前尚不清楚，有待分子機制及臨床試驗進一步研究探討。