趙行宇, 楊 欣, 朱志華, 何 涵, 宋梓桐, 張 巍

（1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院生化教研室，吉林 吉林 132013；2. 延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，吉林 延吉 133000）

宮頸癌在女性惡性腫瘤發(fā)病率中排名第2位［1］，感染人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV） 為宮頸癌發(fā)病的主要原因，其中人乳頭瘤病 毒 16 型 （human papilloma virus type 16，HPV 16）和人乳頭瘤病毒18 型（human papilloma virus type 18，HPV 18）為高危型HPV，通過編碼E6 和E7 病毒性癌蛋白，干擾腫瘤抑制蛋白P53 和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤pRB 引起細(xì)胞異常增殖［2-3］。胡桃醌是一種廣泛存在于胡桃科植物胡桃的未成熟外果皮中的α 萘醌類衍生物［4］，又稱為5-羥基-1，4-萘醌，目前已有研究［5-7］表明胡桃醌具有體外抗腫瘤的作用，如胃癌、卵巢癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等。脯氨酰順反異構(gòu)酶 1 （peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1，Pin1） 是 一 種 在 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起一定作用的小分子蛋白質(zhì)［8］，其在腫瘤細(xì)胞微循環(huán)血管搭建［9］、增殖及轉(zhuǎn)移過程中起主要作用，并在腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)［10-11］。已有研究［12］表明：胡桃醌是Pin1 基因表達(dá)的特異性抑制劑，本課題組前期預(yù)研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌對(duì)Caski 和C33A 細(xì)胞的作用效果不同，推測(cè)其可能與影響Pin1 基因的表達(dá)有關(guān)。為了探討Pin1基因與該作用有關(guān)的可能機(jī)制，本研究通過將胡桃醌對(duì)Caski、shCaski 和C33A 細(xì)胞的作用效果進(jìn)行對(duì)比，闡明胡桃醌對(duì)HPV 陽性和陰性細(xì)胞促凋亡作用差異的機(jī)制，為胡桃醌未來臨床應(yīng)用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器Caski 細(xì)胞系和C33A細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，保存于吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；培養(yǎng)液所用Penicillin-Streptomycin Solution、 胎 牛 血 清 和Dulbecco’s Modified Eagle Medium 培養(yǎng)基均購自杭州四季青公司，并按1∶10∶100 配制；周期與凋亡試劑盒購自碧云天生物有限公司；胡桃醌和溴化四氮唑藍(lán)［3-（4，5-dimethyl-2-thia-zolyl） -2，5-diphenyl-2Htetrazolium bromide，MTT］購自美國Sigma 公司；各類單克隆抗體及二抗購自美國Santa Cruz 公司。MOTIC AE31 顯微鏡購自北京汗盟紫星儀器儀表有限公司，伯樂-550 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自上海領(lǐng)成生物科技有限公司。

1.2 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)建立Pin1 基因敲低細(xì)胞株構(gòu)建Pin1 shRNA （5′-CCACCGTCACACAGTATTTAT-3′） 慢 病 毒 載 體，感 染Caski 細(xì) 胞，用0.5 g·L－1的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲低的細(xì)胞，即shCaki 細(xì)胞。

1.3 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性將瓶內(nèi)培養(yǎng)的Caski、shCaski 和C33A 細(xì)胞用胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞表面無明顯的糖蛋白黏連時(shí)，加一定量含有血清的培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管在1000 g 離心4 min，離心后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，在培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞懸液及一定量培養(yǎng)液，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將配制好的胡桃 醌 以10、20、50 和100 μmol·L－1的 濃 度（10、20、50 和100 μ mol·L－1胡 桃 醌 組） 干 預(yù)24 h，0 μmol·L－1胡桃醌組作為對(duì)照組，5 g·L－1MTT 以每孔20 μL 孵育4 h，DMSO 溶解藍(lán)紫色結(jié)晶在波長490 nm 處測(cè)定各組吸光度（A）值，以A 值表示細(xì)胞增殖活性。

1.4 Hoechst 染色檢測(cè)各組細(xì)胞形態(tài)蓋玻片上接種Caski 細(xì)胞和C33A 細(xì)胞于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)，胡桃醌組以20 μmol·L－1濃度的胡桃醌處理24 h，棄上清液，用多聚甲醛固定15 min。吸去液體，用清洗液洗3 min，重復(fù)2 次，加入0.5 mL Hoechst33258 染色5 min。清洗液清洗2 次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Western blotting 法檢測(cè)2 組細(xì)胞中Pin1 蛋白表達(dá)量收集培養(yǎng)的細(xì)胞，采用PBS 緩沖液洗滌后加入裂解緩沖液裂解細(xì)胞，裂解10 min，1.2×104g 離心10 min，檢測(cè)上清濃度，取5 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，之后轉(zhuǎn)膜。室溫下，PVDF 在5% 非脂肪牛乳中封閉膜2 h，加入Pin1 （1∶2000）和β-actin（1∶1000）一抗，在4 ℃環(huán)境中過夜。第2 天用TBST 洗滌，以1∶10000 稀釋度將膜與二抗在室溫避光條件下孵育2 h，加底物發(fā)光并拍照。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率瓶內(nèi)培養(yǎng)的Caski 和C33A 細(xì)胞用胰蛋白酶消化后離心，用1 mL 冰浴的PBS 緩沖液重懸離心后加入70%乙醇固定30 min。固定好的細(xì)胞用PBS緩沖液再次離心去上清，將事先配制好保存于4 ℃條件下的碘化丙啶（PI）染色液以每管0.5 mL 加入細(xì)胞樣品染色30 min，此過程需要溫浴，并避光，染色完成后進(jìn)行檢測(cè)。觀察不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況收集培養(yǎng)的細(xì)胞，采用冷PBS 緩沖液洗滌后加入裂解緩沖液裂解細(xì)胞，裂解10 min，在1.2×104g 離心10 min，檢測(cè)上清濃度，取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，之后轉(zhuǎn)膜。室溫下，PVDF 在5%非脂肪牛乳中封閉膜2 h， 加 入B 細(xì) 胞 淋 巴 瘤（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、 Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、裂解的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3） 和 PARP （poly ADP-ribose polymerase）（1∶5000），β-actin（1∶1000）一 抗，在4 ℃環(huán)境下過夜。 第2 天用TBST 洗滌，以1∶10000 稀釋度將膜與二抗在室溫避光條件下孵育2 h，加底物發(fā)光并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性、不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率和細(xì)胞凋亡率以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖活性胡桃醌干預(yù)24 h 后，與正常對(duì)照組比較，不同濃度胡桃醌組Caski細(xì)胞增殖活性降低（P＜0.05或P＜0.01）；50和100 μmol·L－1胡桃醌組C33A 細(xì)胞增殖活性降低（P＜0.05）；且相同胡桃醌濃度條件下，Caski 細(xì)胞增殖活性低于C33A 細(xì)胞（圖1A 和B）。采用不同濃度胡桃醌處理shCaski 細(xì)胞，結(jié)果顯示：與Caski 細(xì)胞比較，shCaski 細(xì)胞增殖活性升高（P＜0.05）（圖1C）。

圖1 不同濃度胡桃醌干預(yù)后Caski、shCaski 和C33A 細(xì)胞增殖活性Fig.1 Proliferation activities of Caski, shCaski and C33A cells after treatment of different concentrations of juglone

2.2 2 組Caski 和C33A 細(xì)胞核形態(tài)表現(xiàn)用20 μmol·L－1胡 桃 醌 干 預(yù)Caski 和C33A 細(xì) 胞24 h，與正常對(duì)照組比較，胡桃醌組Caski 細(xì)胞和C33A細(xì)胞中觀察到核皺縮和裂解（箭頭所示），且Caski細(xì)胞核皺縮和裂解多于C33A 細(xì)胞（圖2）。

圖2 胡桃醌干預(yù)后細(xì)胞核形態(tài)(×400)Fig.2 Nucleus morphology after juglone treatment(×400)

2.3 2 組細(xì)胞中Pin1 蛋白表達(dá)量Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：Caski 細(xì)胞中Pin1 蛋白表達(dá)量高于C33A 細(xì)胞（圖3A），胡桃醌干預(yù)后Caski細(xì)胞中Pin1 蛋白表達(dá)量降低（圖3B）；與Caski 細(xì)胞比較，shCaski 細(xì)胞中Pin1 蛋白表達(dá)量降低（圖3C）。

圖3 各組Caski、C33A 和shCaski 細(xì)胞中Pin1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of Pin1 protein expression in Caski, C33A and shCaski cells in various groups

2.4 各組不同細(xì)胞周期Caski 和C33A 百分率采用20 μmol·L－1胡桃醌干預(yù)Caski 和C33A 細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示：胡桃醌干預(yù)后，Caski 細(xì)胞G2期峰值高于對(duì)照組，C33A 細(xì)胞G2期峰值（圖4D）與對(duì)照組相當(dāng)；與對(duì)照組比較，胡桃醌干預(yù)后，G2期的Caski 細(xì)胞百分率由（17.38±2.17）%增 加 至（38.97±3.22）% （P＜0.01），G2期C33A 細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4E。

圖4 胡桃醌干預(yù)后不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率Fig.4 Percentages of cells in cell cycles after juglone treatment

2.5 各組Caski 和C33A 細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，20 μmol·L－1胡桃醌組早期凋亡細(xì)胞量明顯升高；Caski 和C33A 細(xì)胞早期凋亡率均升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖5。

圖5 胡桃醌干預(yù)后各組細(xì)胞早期凋亡率Fig.5 Early cell apoptotic rates after juglone treatment in various groups

2.6 各組Caski 和C33A 細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較，胡桃醌組C33A 細(xì)胞中的共濟(jì)失調(diào)- 毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白（ataxiatelangiectasia mutated proteins， ATM）、 磷 酸 化ATM（phosphorylated ATM，pATM）、磷酸化細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2 （phosphorylated checkpoint kinase 2，pChk2）、磷酸化細(xì)胞分裂周期蛋白25C（phosphorylated Cdc25c，pCdc25c）、216 位絲氨酸磷 酸 化Cdc25c （Ser216 phosphorylated Cdc25c，pCdc25c-Ser216） 和15 位 酪 氨 酸 磷 酸 化Cdc25c（Tyr15 phosphorylated Cdc25c， pCdc25c Tyr15）蛋白表達(dá)量未見明顯改變；Caski 細(xì)胞中pATM、pChk2、pCdc25c Ser216 和pCdc25c Tyr15 蛋 白 表達(dá)量升高，Cdc25c 蛋白表達(dá)量降低，Cdk1 蛋白表達(dá)量變化不明顯。見圖6。

圖6 胡桃醌干預(yù)后2 組細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 6 Electrophoregram of expressions of cell cycle-related proteins in cells after juglone treatment in two groups

2.7 各組Caski 和C33A 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量與 正 常 對(duì) 照 組 比 較，20 μmol·L－1胡 桃 醌 組Caski 細(xì)胞中的Bax 蛋白表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低（圖7A）；Caski 細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)CytC 表達(dá)量升高，線粒體CytC 表達(dá)量降低（圖7B）；Caski細(xì)胞中的Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 蛋白表達(dá)量升高（圖7C）；與對(duì)照組比較，胡桃醌干預(yù)后，C33A 細(xì)胞上述蛋白的表達(dá)量無明顯變化。

圖7 胡桃醌干預(yù)后2 組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.7 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in cells after juglone treatment in two groups

3 討論

胡桃醌的體外抗腫瘤作用已被許多研究［13-21］證實(shí)，同時(shí)也揭示胡桃醌對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞作用機(jī)制會(huì)有所差別。本研究中，胡桃醌對(duì)Caski 細(xì)胞和C33A 細(xì)胞均產(chǎn)生了明顯的生長抑制作用，并隨著胡桃醌濃度的升高作用不斷增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致，同時(shí)本研究也觀察到相同濃度的胡桃醌對(duì)HPV 陽性的Caski 細(xì)胞的抑制作用要高于HPV 陰性的C33A 細(xì)胞。為探索該作用機(jī)制，本研究觀察了胡桃醌對(duì)2 種宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示：胡桃醌導(dǎo)致HPV 陽性細(xì)胞明顯阻滯于G2期，而對(duì)HPV 陰性的細(xì)胞無明顯作用；胡桃醌對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HPV 陽性細(xì)胞的影響亦明顯高于HPV 陰性的細(xì)胞，表明胡桃醌對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長抑制與細(xì)胞周期阻滯導(dǎo)致分裂受阻及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：胡桃醌在HPV 陽性的Caski細(xì)胞導(dǎo)致的核碎裂更多，細(xì)胞早期凋亡率也明顯高于HPV 陰性的C33A 細(xì)胞；針對(duì)胡桃醌對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)HPV 陽性細(xì)胞胡桃醌減少Bcl-2 蛋白表達(dá)而增加Bax 蛋白表達(dá)，線粒體CytC 進(jìn)入胞漿，Caspase-3 激活增加，Cleaved PARP 片段的增加，表明線粒體途徑的凋亡途徑啟動(dòng)；而HPV 陰性的細(xì)胞該變化不明顯，表明胡桃醌對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長抑制作用還與胡桃醌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本研究結(jié)果表明：胡桃醌對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長抑制作用與細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，且對(duì)于HPV 陽性的細(xì)胞生長抑制作用明顯高于HPV陰性的細(xì)胞。Pin1 是細(xì)胞有絲分裂過程中重要的調(diào)節(jié)因子，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長起重要作用，如腫瘤細(xì)胞的血管生成及微循環(huán)搭建均需Pin1 的調(diào)節(jié)［22-24］。本 研 究 進(jìn) 一 步 觀 察 了Pin1 在Caski 和C33A 細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Caski 細(xì)胞中Pin1 表達(dá)水平明顯高于C33A 細(xì)胞；以胡桃醌干預(yù)敲減Pin1基因的shCaski 細(xì)胞，結(jié)果顯示：敲減Pin1 基因后，胡桃醌對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用減弱，與C33A 細(xì)胞相似。本研究結(jié)果提示Pin1 蛋白在HPV 陽性的細(xì)胞和HPV 陰性的細(xì)胞差異是導(dǎo)致胡桃醌對(duì)2 類細(xì)胞作用差異的可能機(jī)制，而深層次的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。