王夢慈,吳志茹,尹曉麗,徐 鵬,趙雯雯,王妍菲,張繼強

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)已經成為一種常見病，在全球影響8%～16%的成年人健康[1]。CKD病人進入終末期腎病(ESRD)者大部分選擇血液透析(hemodialysis，HD)治療，自體動靜脈內瘺(arteriovenous fistulas,AVF)是HD病人長期透析的最理想的血管通路，而內瘺血管鈣化是其失功主要原因之一。血管鈣化主要指血管在多種因素作用下引起血管僵硬度增加，血管的彈性降低，可引起血栓形成，斑塊破裂等后果[2]。內瘺血管鈣化極易造成內瘺血管血栓栓塞、透析時血流動力學異常等各種危險因素引起HD病人無法透析威脅生命。探討內瘺血管鈣化相關影響因素變得尤為重要，其中有研究[3]指出，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)/Smad信號通路參與成纖維細胞生長因子21(FGF-21)對血管鈣化的抑制作用。由于內瘺血管的特殊性，關于FGF-21及BMP-2在內瘺血管鈣化作用研究鮮見報道。本研究旨在探討FGF-21、BMP-2在維持性血液透析病人自體AVF血管鈣化中的作用及其與內瘺血管鈣化的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年8月至2021年6月收治于我科行內瘺修復術及CKD 4～5期初次內瘺病人各20例為觀察組。納入標準：(1)年齡>18歲；(2)病情穩(wěn)定；(3)透析時間>3個月(僅限于行內瘺修復病人或非內瘺透析行初次內瘺病人；(4)AVF以頭靜脈-橈動脈端側吻合；(5)在我院規(guī)律透析病人：每2周透析5次(即每周2次或3次交替)。排除標準：(1)合并乙型肝炎或丙型肝炎、結核等傳染性疾病病人；(2)嚴重疾病的活動期及惡性腫瘤病人；(3)原發(fā)性甲狀旁腺疾病及嚴重的周圍血管病變等影響血管鈣化結果測定的疾??；(4)腹膜透析病人。觀察組共40例，其中男22例，女18例；年齡(55.60±10.48)歲，透析齡(39.98±26.17)個月；原發(fā)?。郝阅I小球腎炎18例，糖尿病腎病12例，高血壓腎損害5例，痛風性腎病1例，多囊腎1例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎1例，不明病因2例。擇同期我院健康體檢中心的健康人群20名作為對照組，其中男10名，女10名。所有研究對象均簽署知情同意書且本研究符合我院倫理學標準。

1.2 方法

1.2.1 生化指標的檢測 所有研究對象采集空腹上肢靜脈血,采用本院自動生化分析儀檢測血鈣(Ca)、血磷(P)、空腹血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、血清肌酐(SCr)、堿性磷酸酶(ALP)、血清尿素氮(BUN)、甲狀旁腺素(PTH)、25-羥-維生素D(25-羥-VD)等水平。

1.2.2 FGF-21、BMP-2的檢測 (1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測：采集清晨空腹靜脈血，2 h內離心取上層血清并迅速放置于-80 ℃冰箱保存，在室溫環(huán)境下復融后采用ELISA測定450 nm波長下的FGF-21、BMP-2吸光度值(OD值)，通過繪制標準曲線測定血清FGF-21及BMP-2濃度，操作步驟均按試劑盒說明書操作，ELISA試劑盒由合肥安啟生物科技有限公司提供。(2)免疫組織化學(免疫組化)染色：按照免疫組化試劑盒操作步驟進行，內瘺血管組織石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水后，通過熱修復抗原后再用5%牛血清白蛋白封閉20 min，分別滴加稀釋的BMP-2 抗體、FGF-21抗體于4 ℃過夜，次日滴加二抗37 ℃孵育 20 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復染，透明，中性樹脂封片在顯微鏡下觀察。其中每項檢測均以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。通過 Image-J分析軟件分析在光鏡下呈黃色顆粒性沉積區(qū)域及程度，無細胞著色為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分；結合FGF-21、BMP-2染色陽性細胞密度進行評分，陽性細胞數≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分。以S表示兩項乘積進而計算FGF-21及BMP-2因子免疫組織化學積分，≤7分為陰性組，>7分為陽性組，進而觀察實驗因子的表達情況。檢測試劑所用的一抗、二抗體均由合肥安啟生物科技有限公司提供。

1.2.3 內瘺血管鈣化的評估 取觀察組病人內瘺血管組織于10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片。采用鈣鹽特異性染色法(茜素紅S法)對其進行鈣化染色,操作步驟均按試劑盒說明書操作，表現為橙紅色即為鈣化染色陽性。對每例切片染色8片，根據鈣化積分取平均值的標準：<1為無鈣化，1～2.5為輕中度鈣化，>2.5～4為重度鈣化，對切片進行評分，根據鈣化積分將觀察組病人分為無鈣化組、鈣化組(輕、中度鈣化組和重度鈣化組)。

1.2.4 肱踝脈搏波傳導速度(baPWV)評估全身血管硬化情況 由本院專業(yè)技術人員采用我院動脈硬化全自動檢測儀BP-203RPE-Ⅲ(PWV/ABI型)檢測baPWV值，取左右兩側baPWV 的高值進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、單因素方差分析和q檢驗、χ2檢驗及 Spearman相關分析。

2 結果

2.1 所有研究對象臨床相關指標情況 初次內瘺組、內瘺修復組和對照組3組間比較，除性別、GLU水平差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05),其他臨床相關指標差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 臨床相關指標的比較

2.2 觀察組不同亞組間臨床相關指標的比較 觀察組40例中內瘺血管鈣化病人共24例，發(fā)生率達60.00%。內瘺血管鈣化病人血FGF-21、BMP-2、P、PTH、SCr水平及baPWV值均明顯高于內瘺血管無鈣化病人(P<0.05～P<0.01)，Ca水平明顯低于無鈣化組(P<0.01),其他臨床指標相比較差異均無統(tǒng)計學意義(見表2)。

表2 臨床相關指標在觀察組不同亞組間的比較

2.3 baPWV評估全身血管硬化情況分析 觀察組與對照組baPWV存在明顯差異，初次內瘺組baPWV為(1 699.50±237.37)cm/s,內瘺修復組為(1 794.00±124.48)cm/s,對照組為(1 273.70±174.43)cm/s,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；內瘺血管鈣化病人baPWV大于非鈣化血管病人(P<0.01)(見表1、2)。

2.4 內瘺血管鈣化與臨床相關指標的相關性分析 Spearman相關分析顯示，觀察組病人內瘺血管鈣化與血清FGF-21、BMP-2、P、SCr、PTH、baPWV均呈正相關(rs=0.850、0.769、0.718、0.433、0.441、0.457，P<0.01)，與Ca、GLU、TC、BUN、ALP、25-羥-VD、性別、年齡指標無相關性(rs=-0.398、-0.113、0.014、0.244、0.006、-0.278、0.084、0.133，P>0.05)。

2.5 免疫組化分析結果 通過觀察所有AVF血管鈣化的標本，FGF-21及BMP-2在鈣化血管壁上均有所表達，大都表現于血管中膜，重度鈣化血管表達量明顯大于輕、中度鈣化血管(見圖1～2)。重度鈣化組FGF-21、BMP-2陽性表達高于輕、中度鈣化組(P<0.05)(見表3)。

表3 重度鈣化組與輕、中度鈣化組免疫組化表達比較

3 討論

自體AVF血管通路是CKD病人HD的生命線，是通過手術使得上肢表淺動脈與靜脈之間相互吻合，促使原始靜脈壁變厚及管腔擴展達到“靜脈動脈化”后進而成熟使用。本研究選擇的組織標本均來源病人的“動脈化”的頭靜脈及初瘺的頭靜脈組織。目前關于CKD病人內瘺血管鈣化原因大都歸因于病人鈣磷代謝紊亂、脂質浸潤、氧化應激和慢性炎癥等原因的不斷刺激，不可忽視的是CKD病人血管鈣化的病理生理基礎更考慮是類似于骨形成的主動調節(jié)過程[4]，主要表現為血管平滑肌細胞發(fā)生成骨樣變化。本研究中內瘺血管鈣化病人不僅鈣磷代謝失調嚴重，血清FGF-21及BMP-2水平均高于正常人及內瘺血管無鈣化病人。

FGF-21是FGF家族的成員,其基因位于人類19號染色體且有4個外顯子編碼209個氨基酸的肽(前FGF-21) ，于2000年首次被鑒定，與鼠FGF-21有75%的同源性[5]。成熟的FGF-21是切割28個氨基酸的N端信號肽后形成一種181個氨基酸的蛋白質，相對分子質量約為20 kDa[6]。關于尿中FGF21水平的數據很少[7]，根據推斷，腎清除率仍被認為是其主要排泄途徑，對于CKD病人，循環(huán)中的FGF-21水平與SCr呈正相關，與腎小球濾過率呈負相關，且從早期腎病發(fā)展到后期ESRD狀態(tài)，FGF-21水平不斷升高[8]。本研究中也證實隨著病人疾病進展，FGF-21水平不斷增高。FGF-21作用的實施需要借助FGF受體和輔助因子β-Klotho(β-Klotho是一種單通道跨膜蛋白，是FGF-21信號傳遞的專屬輔因子)[9]。FGF-21通過減少礦物質沉積[10]和內質網應激介導的凋亡[11]，降低成骨細胞基因的表達和抑制血管平滑肌細胞的成骨轉化[12]來抑制血管鈣化及其進展。FGF-21通過OPG/RANKL系統(tǒng)抑制血管鈣化[13-14],且能夠顯著下調Runx2和ALP的表達，這兩種蛋白是成骨細胞分化的標志物和積極調節(jié)因子[15-16]。隨著血管鈣化程度的加重，血清FGF-21不斷升高進而抑制血管鈣化的進展。本研究中亦觀察到內瘺血管鈣化組血清中FGF-21表達高于內瘺無鈣化組，且FGF-21在鈣化程度越高的血管壁上的免疫組織表達也越強，與上述關于FGF-21在慢性腎臟病中的研究結果一致。

BMP屬于轉化生長因子β超家族成員[17]且是一種多功能的生長因子，其中BMP-2是成骨細胞分化和骨形成所需的有效成骨蛋白。BMP-2主要通過依賴于Ⅰ型和Ⅱ型受體以及細胞內的信號分子 Smad發(fā)揮生物學效應，BMP-2/Smad 信號通路在成骨細胞分化和骨形成中起關鍵作用[18]。在該途徑中，BMP-2配體結合并激活跨膜受體Ⅰ(BMPR-ⅠA) 和Ⅱ(BMPR-Ⅱ)[19]，然后激活的BMPR-ⅠA通過 Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)[20]的募集和磷酸化來傳遞信號進而轉移至細胞核內調節(jié) Runx2和ALP的表達來引起血管的鈣化。由于動靜脈內瘺血管的特殊性，可通過BMP-2的血清值及在血管壁上的表達情況反映病人血管的鈣化程度。在本次研究中可觀察到內瘺血管鈣化病人血清中BMP-2水平明顯高于內瘺血管無鈣化病人且在不同鈣化水平血管壁上的表達存在一定差異。

綜上所述，本研究可證實FGF-21、BMP-2水平升高與自體AVF血管鈣化相關，可將其作為預測內瘺病人血管鈣化的參考指標。但本研究由于樣本量較小及研究時間與條件有限，存在一定的限制性，后期仍需要擴大樣本量做更深入層次研究。