丁麗紅，張 森，余 慧，陳 丹，余忠山，李培坤，倪海鋒，王德光

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)(secondary hyperparathyroidism，SHPT)是慢性腎臟病病人最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[1]，在透析病人中SHPT的發(fā)病率可高達(dá)50%，且嚴(yán)重影響透析病人的生活質(zhì)量和生存率[2]。目前對SHPT的發(fā)病機制、疾病進(jìn)展影響因素及預(yù)后等方面的研究尚不深入，需進(jìn)一步研究。越來越多的證據(jù)支持慢性炎癥是導(dǎo)致細(xì)胞增生和腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的確切因素之一，NOD樣受體家族蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小體是目前研究最為深入且在多種細(xì)胞中表達(dá)的炎性體[3]，其在細(xì)胞增生及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等方面的起到一定作用，但NLRP3在SHPT中的作用尚未闡明。本研究旨在探討NLRP3在SHPT中的表達(dá)情況，并分析其與SHPT臨床病理特征的關(guān)系。現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年10月至2019年4月因SHPT行手術(shù)切除的甲狀旁腺組織和術(shù)前血清標(biāo)本各88例，收集因甲狀腺癌行甲狀腺全切除術(shù)并在病理切片中發(fā)現(xiàn)正常甲狀旁腺組織且無腎臟病者10例。收集健康體檢人群的血清標(biāo)本14例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 從病理科調(diào)取相關(guān)病例的甲狀旁腺組織蠟塊，切片(厚3～4 μm)常規(guī)脫蠟，水化，行HE染色。每例切片顯微鏡下隨機選取10個互不重疊的視野進(jìn)行觀察拍照，分別由2名病理醫(yī)生明確診斷。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 蠟塊切片(厚3～4 μm)常規(guī)脫蠟，水化，枸櫞酸鈉、微波修復(fù)后，按免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新)說明書步驟檢測NLRP3(1∶100，美國Santa Cruz)，PBS作為陰性對照，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 ELISA檢測 收集88例SHPT病人術(shù)前血清和14名健康體檢人群的血清標(biāo)本，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒(武漢基因美)說明書步驟檢測血中NLRP3水平。

1.3 結(jié)果判讀 NLRP3蛋白免疫組織化學(xué)陽性主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。隨機選取10個高倍鏡視野，分別由2名病理醫(yī)生判讀，以陽性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的比例分級，采用半定量法進(jìn)行染色結(jié)果判讀：無明顯陽性細(xì)胞為陰性(-)，<25%為弱陽性(+)，25%～50%為陽性(2+)，>50%為強陽性(3+)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗和秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 88例SHPT病人中男54例，女34例；年齡30～73歲，中位年齡50歲；血液透析75例，腹膜透析4例，血液透析聯(lián)合腹膜透析9例；透析齡1～16年，平均8年，其中≤5年21例，>5～<10年36例，≥10年31例。

2.2 鏡檢 HE染色切片顯示，正常的甲狀旁腺腺細(xì)胞排列成索團(tuán)狀，其間富含有孔毛細(xì)血管及少量結(jié)締組織，還可見較多的脂肪細(xì)胞(見圖1)；SHPT病人甲狀旁腺中主細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞普遍體積變大，排列成彌漫性的實性片狀(見圖2)，或者呈結(jié)節(jié)、梁狀、濾泡狀、腺泡樣形態(tài)，也可以呈菊形團(tuán)樣、乳頭狀，常見的是不同排列形態(tài)混合形成腺瘤樣增生，間質(zhì)內(nèi)僅見少量脂肪細(xì)胞，周圍有纖維結(jié)締組織分隔(見圖3)。

2.3 NLRP3在SHPT病人和正常健康人血清中的表達(dá) 88例SHPT病人的術(shù)前血清NLRP3的表達(dá)水平為(290.66±72.53)，明顯高于健康體檢人群的血清NLRP3的水平(75.59±20.05)(t′=22.86，P<0.01)。

2.4 NLRP3蛋白在正常甲狀旁腺組織及SHPT病人的甲狀旁腺組織中的表達(dá) 檢測88例SHPT病人的甲狀旁腺組織和10例因甲狀腺疾病行甲狀腺全切手術(shù)時帶有正常甲狀旁腺且無腎臟病者的甲狀旁腺組織，結(jié)果NLRP3蛋白在正常甲狀旁腺組織中的陽性率為20.00%，且為弱陽性(見圖4)，NLRP3蛋白在SHPT病人的甲狀旁腺組織中的陽性率為95.45%，表現(xiàn)為不同程度的陽性(見圖5～7)。NLRP3蛋白在SHPT病人異常增生的甲狀旁腺組織中的表達(dá)率顯著高于正常甲狀旁腺組織(P<0.01)(見表1)。不同性別、年齡、透析方式、透析齡等SHPT病人甲狀旁腺組織中NLRP3蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表1 NLRP3在正常甲狀旁腺組織及SHPT病人的甲狀旁腺組織中的表達(dá)

表2 不同臨床參數(shù)SHPT病人甲狀旁腺組織中NLRP3蛋白表達(dá)

3 討論

SHPT是慢性腎臟病病人，尤其是透析病人最常見的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致皮膚瘙癢、骨骼畸形、身高縮短、面貌改變、血管鈣化等，鈣磷代謝紊亂嚴(yán)重者可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化、骨痛、病理性骨折等諸多癥狀，明顯影響了病人的生存質(zhì)量，增加了治療費用。因此，探討SHPT的發(fā)病機制、疾病進(jìn)展影響因素及預(yù)后等有重要的經(jīng)濟和社會意義。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為慢性腎臟病病人出現(xiàn)SHPT的根本原因是增生的甲狀旁腺組織分泌過量的甲狀旁腺激素(PTH)，PTH可促進(jìn)骨溶解，使鈣磷釋放入血，促進(jìn)腎小管對鈣離子的重吸收和磷酸鹽的排泄，使血鈣濃度增加和血磷濃度下降，代償性維持血鈣、血磷正常。而發(fā)生SHPT的主要機制是，慢性腎功能不全時腎小球濾過率下降，腎臟排磷減少，血磷增高，高磷血癥可引起血鈣降低。同時由于腎1α-羥化酶缺乏，1,25(OH)2D3生成受阻，腸鈣吸收不足、排出增多，血鈣降低，低血鈣和高血磷刺激甲狀旁腺腺體增生和肥大[4]。甲狀旁腺細(xì)胞最初表現(xiàn)為彌漫性增生，長期的低鈣、高磷刺激使甲狀旁腺進(jìn)一步增大，可呈結(jié)節(jié)性增生，甲狀旁腺由代償性功能亢進(jìn)發(fā)展成自主性功能亢進(jìn)，最終形成甲狀旁腺腺瘤，合成、分泌過量的PTH[5]，從而導(dǎo)致一系列癥狀的出現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)SHPT病人的甲狀旁腺組織可呈彌漫性或腺瘤樣增生，鏡下形態(tài)表現(xiàn)多種多樣。

在慢性炎癥的長期刺激下，炎癥調(diào)節(jié)因子和炎癥細(xì)胞可導(dǎo)致增生的細(xì)胞在基因水平發(fā)生變化，甚至發(fā)生瘤變、癌變等[6]。炎性體是機體固有免疫及應(yīng)激系統(tǒng)的重要防御成分，其中各種內(nèi)源性或外源性的刺激可通過不同的信號通路激活NLRP3炎性體，使caspase-1活化，引起白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子成熟分泌，進(jìn)而促進(jìn)炎癥和腫瘤的發(fā)生。近年來，NLRP3炎性體在炎癥及纖維化中的研究較多，我們既往的研究[7-9]表明，腎小管上皮細(xì)胞在長期大量蛋白尿的慢性刺激下可發(fā)生NLRP3炎性體激活，IL-1β和IL-18水平升高，間質(zhì)內(nèi)有較多的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致慢性腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化的發(fā)生，從而導(dǎo)致慢性腎臟病的進(jìn)展。

隨著對NLRP3炎性體研究領(lǐng)域的逐漸擴大，近幾年的研究著重于NLRP3在細(xì)胞增生及腫瘤方面的作用，從新的視角研究炎癥相關(guān)的增生及腫瘤的發(fā)病機制以及治療方法已成為NLRP3炎性體研究領(lǐng)域的新熱點[10]。據(jù)報道，幽門螺桿菌感染可導(dǎo)致胃慢性炎癥和介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子如NLRP3炎性體激活后的產(chǎn)物IL-1β、腫瘤壞死因子α、IL-6釋放增加，可能引發(fā)胃黏膜上皮細(xì)胞增生和癌變[11]。NLRP3炎性體與細(xì)胞周期蛋白-D1啟動子結(jié)合并促進(jìn)其在胃上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，NLRP3可能與增強上皮細(xì)胞增生和胃腫瘤的發(fā)生有關(guān)。此外，IL-1β與其受體結(jié)合并激活NF-κB，啟動JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起上皮細(xì)胞的增生、侵襲和癌癥發(fā)展[12]。LI等[13]發(fā)現(xiàn)，MiR-22是胃黏膜上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中NLRP3下調(diào)的必需調(diào)節(jié)劑，這表明MiR-22在抑制NLRP3炎性體表達(dá)中具有重要作用，而MiR-22可直接靶向抑制NLRP3并在體外和體內(nèi)減弱其致癌作用。HUANG等[14]研究表明頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中NLRP3炎性體表達(dá)升高，其表達(dá)程度與疾病預(yù)后相關(guān)，通過NLRP3炎性體途徑誘導(dǎo)活性IL-1β的產(chǎn)生，抑制NLRP3炎性體途徑被認(rèn)為是降低腫瘤細(xì)胞侵襲的有效方法。NLRP3炎性體相關(guān)基因多態(tài)性還與慢性粒細(xì)胞白血病(CML)有關(guān)，與對照相比，CML病人中IL-1β或NLRP3 mRNA表達(dá)降低并且IL-18 mRNA表達(dá)顯著增加，NLRP3炎性體的遺傳多態(tài)性可作為CML的潛在預(yù)測因子[15]。本研究發(fā)現(xiàn)SHPT病人的甲狀旁腺組織中NLRP3蛋白的表達(dá)明顯強于正常甲狀旁腺組織，且血清中NLRP3的水平也較正常人明顯升高，這提示SHPT病人體內(nèi)可能存在NLRP3炎性體的激活，這可能與甲狀旁腺細(xì)胞在長期低鈣、高磷刺激下引起NLRP3炎性體激活有關(guān)，NLRP3炎性體激活后導(dǎo)致IL-1β和IL-18水平升高，引起慢性炎癥的發(fā)生，而甲狀旁腺組織在長期慢性炎癥的刺激下出現(xiàn)了甲狀旁腺組織的彌漫性增生或腺瘤樣增生異常增生。

綜上所述，NLRP3在SHPT病人異常增生的甲狀旁腺組織中表達(dá)水平明顯高于正常甲狀旁腺組織，且NLRP3的表達(dá)與病人性別、年齡、透析方式、透析齡等均無關(guān)，NLRP3可能參與SHPT的發(fā)生、發(fā)展，NLRP3可作為SHPT早期診斷及預(yù)后評估的重要指標(biāo)。