湯 陽，朱飛宇，孫 碩，戎 李，趙 懿，張 恒，高 琴，康品方

急性冠狀動脈綜合征(ACS)是臨床常見的危重疾病，是在冠狀動脈粥樣硬化斑塊固定存在的基礎(chǔ)上，繼發(fā)斑塊侵襲與破裂，形成完全或不完全閉塞性血栓導(dǎo)致的一組臨床綜合征[1]。其包括：不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)、非ST段抬高型心肌梗死和ST段抬高型心肌梗死。據(jù)報道，2015年我國農(nóng)村急性心肌梗死(AMI)死亡率達到70.09/10萬人，城市死亡率為56.38/10萬，住院總費用高達152.40億元[2]，心血管疾病發(fā)病率及死亡率增長勢頭未減，已成為危害我國公民健康的主要因素，故掌握冠心病的發(fā)病機制、尋找更精準的病情評估指標具有十分重要的意義，而無創(chuàng)、易獲取的血液學(xué)指標成為重點篩查對象。

程序性壞死是細胞受到精密的程序調(diào)控而發(fā)生的壞死性死亡，是非caspase依賴的細胞死亡通路，相關(guān)研究已證實其參與冠狀動脈斑塊形成、心肌缺血再灌注損傷、心肌細胞壞死及纖維化心室重塑等多個病理過程[3-5]。其中刺激受體相互作用蛋白1(RIP1)-RIP3-混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶(MLKL)是研究較為透徹的經(jīng)典的通路。KARUNAKARAN等[6]發(fā)現(xiàn)MLKL在動脈粥樣硬化病人的斑塊核內(nèi)是高度活躍的，說明程序性壞死可能是導(dǎo)致冠狀動脈易損性的始動因子之一，可作為診斷及治療靶點。但目前仍缺乏大樣本的臨床試驗證明MLKL及ACS之間的關(guān)系。本研究選取對照組、UAP及AMI組，對比觀察RIP1、RIP3和MLKL的組間表達差異，探討RIP1-RIP3-MLKL通路和ACS疾病進程之間的關(guān)系。 現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至 2019年6月經(jīng)門診或急診收住入院的初診ACS的病人60例，其中UAP病人31例，AMI病人20例，以上病人入院后均經(jīng)冠狀動脈造影證實并成功實施冠狀動脈支架植入術(shù)。并選取同期健康體檢者19名為對照組，均無冠心病病史及心絞痛相關(guān)癥狀。UAP診斷參考2011年美國心臟病學(xué)學(xué)會基金會/美國心臟協(xié)會(ACCF/AHA)的診斷標準[7]。AMI診斷標準參考2012ESC的診斷標準[8]。排除標準包括：(1)有明確的惡性腫瘤病史；(2)嚴重的肝腎功能不全；(3)有明確的血液系統(tǒng)疾??；(4)有明確的免疫性疾病等炎性疾??；(5)有明確的甲狀腺功能亢進等甲狀腺疾病；(6)有其他引起胸痛的原因如肺栓塞、心肌病、主動脈瘤、心臟瓣膜病及充血性心力衰竭等；(7)上呼吸道、肝臟、腎臟等感染性疾??；(8)糖尿病等慢性代謝性疾病。研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，入選對象均簽署了知情同意書。

1.2 樣本制備 清晨或急診冠狀動脈介入術(shù)前采集受試者空腹外周靜脈血共約12 mL，分為10 mL及2 mL兩份，肝素抗凝；參照朱建等[9]方法分離外周血單個核細胞，流式細胞儀檢測，計算CD14陽性率；另一份2 mL外周靜脈血經(jīng)2 500 r/min離心5 min后收集上層血漿，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA法檢測外周血漿中白細胞介素(IL)-1、IL-18及MLKL的含量 嚴格按照ELISA試劑盒說明書的步驟進行操作，待檢測樣品及標準品均為復(fù)孔上樣，最后在酶標儀上讀取450 nm處吸光度值，求平均值并建立標準曲線，按照得出的公式計算出對應(yīng)樣品血漿中IL-1、IL-18及MLKL的含量。

1.4 qRT-PCR提取核RNA 采用Trizol法提取外周血單核細胞(PBMCs)總RNA，提取后的RNA A260/A280均在1.8～2.0，取1 μg RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，獲得的cDNA按照試劑盒(TaKaRa)說明進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：SYBR Green PCR Master Mix(2×)10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dd H2O 7 μL，反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)參數(shù)95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。引物由上海生物工程有限公司合成，以人β-actin為內(nèi)參。MLKL引物序列為：上游引物 5′-CAG AAA CAT CAG CAG CTC CA-3′，下游引物 5′-ATG ATT TCC CGC AAC AAC TC-3′。β-actin引物序列為5’-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′(上游)，5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′(下游)，產(chǎn)物大小為202 bp。qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后取擴增產(chǎn)物進行2 %瓊脂糖凝膠電泳目的條帶，擴增結(jié)果采用2-△△Ct法分析。

1.5 Western blotting 提取PBMCs總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，每孔取20 μg蛋白95 ℃變性后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠100 V、200 mA電泳分離樣品蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入MLKL、RIP1和RIP3一抗(1∶1 000，Sigma)，置搖床4 ℃孵育過夜，經(jīng)PBST洗膜3次后加入HRP標記二抗(1∶5 000，Amersham)，37 ℃孵育，室溫振搖2 h。洗膜后取5 mL BCIP/NBT顯色液(Invitrogen)按照顯色試劑說明書進行顯色。用Quality圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行灰度分析，β-actin的表達水平作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析、q檢驗和χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組臨床資料比較 3組間年齡、高血壓、糖尿病、白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、載脂蛋白A、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素(TBil)、總蛋白差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而AMI組中血清總膽固醇(TC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和血肌酐(Cr)水平明顯高于UAP組和對照組(P<0.05)(見表1)。

表1 病人基線資料比較

分組nHDL/(mmol/L)LDL/(mmol/L)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/(IU/L)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/(IU/L)TBil/(μmol/L)總蛋白/(g/L)Cr/(mg/L)對照組191.06±0.262.12±0.7120.42±3.52 21.70±11.569.83±3.8165.71±5.6159.00±14.14UAP組310.93±0.172.21±0.6920.97±6.9019.16±10.6010.32±4.3965.87±4.9765.52±10.72AMI組200.94±0.272.65±1.0232.35±18.97?#19.79±10.5010.10±5.6066.29±7.2979.78±42.88?F—2.142.577.590.330.070.053.59P—>0.05>0.05<0.01>0.05>0.05>0.05<0.05MS組內(nèi)—0.0520.644126.697117.47721.42634.586626.592

2.2 3組外周血漿IL-1、IL-18和MLKL含量比較 3組受試者血漿IL-1、IL-18含量和MLKL含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表2 3組外周血漿IL-1、IL-18和MLKL含量比較

2.3 PBMCs的鑒定 PBMCs經(jīng)CD14-抗體結(jié)合磁珠提純并經(jīng)流式鑒定，得到的人PBMCs純度>90%(見圖1)。

2.4 PBMCs中MLKL的mRNA表達 qRT-PCR結(jié)果顯示UAP組MLK mRNA表達量較對照組明顯升高(P<0.05)，AMI組MLKL mRNA高于對照組和UAP組(P<0.05)(見表3)。

表3 各組PBMCs中MLKL mRNA的表達

2.5 PBMCs中MLKL、RIP1、RIP3的蛋白表達 與對照組比較，UAP組MLKL、RIP1和RIP3的蛋白表達升高(P<0.05)；與UAP組比較AMI組MLKL、RIP1和RIP3的蛋白表達進一步升高(P<0.05)(見表4)。

表4 各組PBMCs中的RIP1、RIP3和MLKL蛋白表達變化

3 討論

冠心病的發(fā)生發(fā)展和環(huán)境、行為及遺傳因素等息息相關(guān)。其中，高膽固醇水平是重要的危險因素，長期脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致巨噬細胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，加速斑塊形成。炎癥同樣是動脈粥樣硬化的重要驅(qū)動因素，而晶體膽固醇作為內(nèi)源性危險信號，沉積在動脈壁或其他部位是炎癥的早期原因[10]。心腦血管疾病中，最常見的是NLRP3炎癥反應(yīng)體，由NLRP3、Asc和caspase 1組成，這種多聚復(fù)合物的激活啟動下游反應(yīng)，包括促炎癥細胞因子IL-1β和IL-18的成熟[11]。IL-1β和其他IL家族細胞因子是重要的血管和全身炎癥介質(zhì)，同時也在冠心病發(fā)生發(fā)展扮演重要角色[12]。因此本研究選取IL-1、IL-18作為炎癥觀察指標，發(fā)現(xiàn)UAP病人IL-1、IL-18水平較正常對照組增加，這提示斑塊形成過程是長期低水平的促炎狀態(tài)，隨著病程進展，在斑塊脫落或堵塞管腔的一瞬間，機體產(chǎn)生促炎風(fēng)暴。研究亦顯示AMI組較UAP組IL-1、IL-18進行性升高。SANDANGER等[13]發(fā)現(xiàn)敲除ASC和NLRP 3基因也顯示梗死范圍明顯縮小并保留心功能，因此IL-1、IL-18作為心肌梗死的危險性因素，其下調(diào)有助于心功能的恢復(fù)。

RIP1-RIP3-MLKL是近年的研究熱點通路。既往我們所熟知的細胞因子，如RIP1、Fas相關(guān)蛋白結(jié)合死亡域(FADD)、TNF受體相關(guān)因子2(TRAF 2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和caspase 8等，均參與凋亡程序中[14]。而當(dāng)caspase 8的狀態(tài)被抑制或MLKL的表達水平較高，細胞可發(fā)生程序性死亡。其中，RIP1和RIP3是關(guān)鍵激酶，MLKL磷酸化也是死亡的直接執(zhí)行者，MLKL的蘇氨酸357和絲氨酸358結(jié)構(gòu)域被RIP3磷酸化，激活下游反應(yīng)，誘導(dǎo)程序性壞死程序的發(fā)生[15-19]。巨氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)可以在生理狀態(tài)下通過直接促進巨噬細胞中RIP3和MLKL的表達及活化誘導(dǎo)程序性壞死[6]。然后泡沫細胞在血管壁內(nèi)發(fā)生壞死，增加斑塊不穩(wěn)定性。UAP時期，狹窄的冠狀動脈痙攣，或運動后不穩(wěn)定斑塊表面纖維帽破裂，血小板黏附，造成心肌細胞短時間的缺血缺氧，產(chǎn)生痛感，病人因此入院。本研究顯示，UAP時期病人PBMCs中RIP1、RIP3和MLKL水平明顯上調(diào)，PCR及Elisa檢測MLKL水平也上調(diào)，說明這一時期，MLKL表達增多，缺氧的心肌細胞在TNF-α的介導(dǎo)下，程序性壞死水平激活。

心肌缺血再灌注損傷指的是硬化的冠狀動脈部分或完全急性阻塞后一定時間內(nèi)血液再通時，缺血的心肌雖然血供得以恢復(fù)，但其組織損傷有時卻呈進行性不可逆加重[20]。OERLEMANS等[21]發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷后的心肌細胞中RIP1、RIP3和MLKL蛋白含量明顯上調(diào)，NEC-1，一種特異性程序性壞死抑制劑，能抑制RIP1/3磷酸化和MLKL募集，下調(diào)RIP1、RIP3和MLKL，減輕心肌細胞損傷，提高對氧化應(yīng)激的抵抗力和減少線粒體功能障礙，對心肌缺血/再灌注后短期和長期心功能的恢復(fù)都是有益的。有鑒于此，本研究旨在探討較正常人群比較，ACS病人血漿及PBMCs中程序性壞死通路關(guān)鍵因子的表達變化，為此收集20例心肌梗死病人血標本，發(fā)現(xiàn)AMI組病人外周血漿中MLKL進一步升高，RIP1和RIP3的蛋白表達的上調(diào)，MLKL的mRNA和蛋白表達上調(diào)。也側(cè)面說明長期心肌細胞缺氧時，全面調(diào)動體內(nèi)炎癥水平的同時，程序性壞死也是高度激活的。也有報道說明程序性壞死可能參與肌鈣蛋白形成過程[22]。我們推測：AMI時，心肌細胞不可逆損傷，炎癥因子大幅釋放，RIP1、RIP3和MLKL上調(diào)，與此同時高表達的程序性壞死，增加細胞膜內(nèi)外離子濃度梯度，加速心肌細胞膜破裂，加劇體內(nèi)炎癥水平。從正常組至UAP及AMI，隨著心肌細胞損傷程度增加，RIP1、RIP3和MLKL表達遞增。RIP3除了通過細胞凋亡和炎癥外，還通過激活Ca2+-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(CaMKII)而不是我們上述的經(jīng)典的RIP1、RIP3和MLKL來觸發(fā)心肌細胞壞死[23]。RIP3缺乏或CaMKII抑制可改善缺血再灌注或阿霉素治療所致的心肌壞死和心力衰竭[24]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死通路參與ACS病程始終，與ACS病人體內(nèi)炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。從RIP1-RIP3-MLKL在不同類型ACS病人中表達的差異，我們推測血漿RIP1、RIP3和MLKL是的ACS危險因素，可作為ACS篩查的替代標志物。血漿和PBMCs中MLKL等水平與心肌細胞損傷程度及其臨床表現(xiàn)呈正相關(guān)。這表明血漿MLKL有望成為預(yù)測ACS疾病的嚴重程度的指標，為ACS早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療提供莫大的幫助。