蔡 昊,桂 崢,楊 錚,李 妍,劉 娜,霍哈日汗,卜凡一,鄒振雨,段雅干,劉陶迪

目前，CRISPR/Cas9技術(shù)是最強(qiáng)大的基因組編輯工具，由CRISPR RNA(crRNA)和Cas9核酸酶組成，DNA由Cas9引導(dǎo)并切割，導(dǎo)致靶位點(diǎn)雙鏈斷裂。在細(xì)胞DNA修復(fù)過程中，靶位點(diǎn)處發(fā)生目的基因片段插入、替換或刪除[1]。CRISPR/Cas9有效地應(yīng)用于基因敲除、內(nèi)源性基因表達(dá)調(diào)控、活細(xì)胞標(biāo)記染色體位點(diǎn)、編輯單鏈RNA和高通量基因篩選。CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用擴(kuò)大了研究基因功能研究的樣本種類，可以應(yīng)用于發(fā)育機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控和動物行為等方面。同時，CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用有助于研究人員闡明靶基因功能，使研究特定基因功能成為可能[2-3]。因此，本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)高效構(gòu)建Trib3基因敲除大鼠模型。

Trib3基因位于人類染色體20p13-p12.2，包括4個外顯子和3個內(nèi)含子，TRIB3含有358個氨基酸殘基[4]。Trib3基因是哺乳動物Tribbles家族的成員，Tribbles家族由Trib1、Trib2和Trib3三種基因組成[5]。目前有研究[6-8]表明Trib3在肝臟中被誘導(dǎo)表達(dá)，TRIB3通過直接與Akt結(jié)合，從而促進(jìn)了Ⅱ型糖尿病易感性個體的胰島素抵抗。另一項(xiàng)研究[9]表明TRIB3與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CtIP(Ctbp-interactions protein)相互作用，不僅破壞正常的細(xì)胞周期導(dǎo)致細(xì)胞癌變，還在癌細(xì)胞中過表達(dá)。TRIB3在結(jié)腸細(xì)胞中與β-catenin和TCF4相互作用，增加腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，敲除Trib3基因后可有效減少小鼠結(jié)腸腫瘤細(xì)胞數(shù)量[10]。TRIB3在肺癌組織中的表達(dá)顯著增加，并與肺癌病人的生存時間呈反比。同時，TRIB3亦在其他類型的腫瘤中誘導(dǎo)表達(dá)[11]。有研究[12]顯示TRIB3的表達(dá)與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)，HIF-1α作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控血管生成、攜氧蛋白和葡萄糖代謝酶等多種相關(guān)基因的表達(dá)，是腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。TRIB3通過抑制AKT信號通路從而抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡[13]。Trib3基因除了與癌癥有關(guān)，該基因也可以促進(jìn)成骨發(fā)育[14]。但是，Trib3基因在精子發(fā)生中的作用鮮有報道，劉陶迪[15]通過高通量基因芯片技術(shù)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Trib3基因在精子發(fā)生過程中的表達(dá)差異性有20.3倍之多。因此，建立Trib3基因敲除大鼠模型來研究該基因在精子發(fā)生中功能具有重要意義。本研究中對基因敲除大鼠的基因型鑒定是Trib3基因功能研究的前期工作和重要環(huán)節(jié)，可為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 基因敲除大鼠由北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司提供，品系為Wistar大鼠[許可證號:SCXK(京)2019-0002]。通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除大鼠Trib3基因。Trib3基因敲除大鼠飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級鼠房飼養(yǎng)和繁殖。

1.2 主要試劑及儀器 血液組織DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit,天根生化有限公司)；PGK1.1 linear vector(南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院提供)；2×San Taq PCRMix(Dye)(上海生工生物工程股份有限公司)；invitrogen瓊脂糖(美國Thermo Fisher Scientific)；6×Loading buffer(武漢Biosharp生物技術(shù)有限公司)；GoldView Ⅰ型核酸染色劑(北京Solarbio科技有限公司)；D2000 DNA Marker[天根生化(北京)有限公司]；超微量紫外分光光度儀(Thermo ND 2000L)；PCR擴(kuò)增儀(威泰克公司)；水平電泳儀(北京柏奧易杰科技有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國美國UVP公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CRISPR/Cas9敲除Trib3基因 Trib3基因位于大鼠第3號染色體，Trib3基因編碼蛋白的主要有1種剪接體：Trib3-201，編碼349個氨基酸殘基的蛋白，Trib3基因的3號外顯子長度293 bp，非3的整數(shù)倍，刪除后將造成后續(xù)編碼區(qū)移碼突變，導(dǎo)致Trib3基因功能喪失。因此本實(shí)驗(yàn)將Trib3基因的3號外顯子刪除。用大鼠Trib3基因特異sgRNA(single-guide RNA)介導(dǎo)Cas9核酸酶切割DNA出現(xiàn)特定的DSBs(Double-Stranded Breaks)，在剪接體Trib3-201的3號外顯子的上游及下游切口，通過NHEJ(Non-homologous end Joining)修復(fù)途徑，將2個切口直接連接，同時刪除兩個切口之間的序列(即3號外顯子)。用CRISPR Design設(shè)計篩選得到2個gRNA，分別是Trib3-gRNA1為5′-TGA GTC TAG TCA GCG GAG CAG GG-3′；Trib3-gRNA3為5′-ACT AAA GGA ATA GCT GCG GGT GG-3′。將純化好的sgRNA、Cas9-mRNA共同注射到Wistar大鼠胚胎中，注射后將胚胎移植到代孕受體大鼠的輸卵管內(nèi)，胚胎移植后3～4周大鼠出生，出生2周左右完成基因型鑒定。

1.3.2 提取DNA 對出生后8～10 d的大鼠進(jìn)行剪腳趾標(biāo)記編號。剪取8～10日齡大鼠腳趾，裝入0.2 mL PCR管。加入200 μL緩沖液GA，用眼科剪剪碎，注射器抽打10次。加入20 μL Proteinase K溶液，混勻。56 ℃水浴過夜，直至組織溶解后。動物組織DNA提取參考總DNA試劑盒(TIANGEN,DP304)說明書進(jìn)行操作，以ddH2O作為陰性對照品，使用超微量紫外分光光度儀(Thermo ND 2000L)測定DNA濃度(Conc)及DNA純度，A260/A280比值在1.8左右為DNA純度合格，濃度結(jié)果在100～300 ng/μL。

1.3.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 引物由北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司設(shè)計、合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，62 ℃ 25 s，72 ℃ 40 s，38個循環(huán)，72 ℃ 2 min結(jié)束。

表1 寡核苷酸引物列表

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 電泳條件：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL，6×Loading buffer 1.0 μL，1.3%瓊脂糖凝膠，100 V恒壓50 min，使用凝膠成像系統(tǒng)(美國美國UVP公司)拍照。

2 結(jié)果

2.1 F0代founder大鼠基因型鑒定 應(yīng)用CRISPR/Cas9敲除大鼠Trib3基因，Trib3基因的3號外顯子長度293 bp，非3的整數(shù)倍，刪除后將造成后續(xù)編碼區(qū)移碼突變，從而導(dǎo)致Trib3基因功能喪失(見圖1)。獲得F0代大鼠(見表2)，對F0代founder大鼠敲除及鑒定見圖1～3。大鼠編號分別為8734♀、8735♀、8737♂、9041♂，4只F0代founder大鼠為基因敲除大鼠，其中9041♂founder大鼠死亡，最終獲得1雄2雌共3只F0代founder大鼠，分別為8734♀、8735♀、8737♂。

表2 F0代基因敲除大鼠出生情況

2.2 F1代大鼠基因型鑒定 大鼠的性成熟期約為8周，母鼠妊娠期約為21 d，采用8734♀×8737♂、8735♀×wistar♂進(jìn)行繁殖，獲得F1代大鼠(見表3)，對出生的F1代大鼠進(jìn)行鑒定(見圖4～6)。F1代大鼠10156～10166是8734♀×8737♂所生；F1代大鼠10167～10181是8734♀×8737♂所生，對F1代樣品進(jìn)行測序，將刪除序列相同的大鼠歸為一組(line)，分為3個line，lineA：10156、10157、10159、10160、10164、10166來源于8734♀×8737♂，經(jīng)測序，刪除序列與founder鼠8734完全相同；lineB：10167、10169、10170、10179、10180來源于8735♀×wistar♂，經(jīng)測序，刪除序列與founder鼠8735完全相同；lineC：10168、10171、10177、10178來源于8735♀×wistar♂，經(jīng)測序，刪除序列與founder鼠不同。

表3 F1代基因敲除大鼠出生情況

續(xù)表3

2.3 F2代大鼠基因型鑒定 經(jīng)CRISPR/Cas9敲除Trib3基因相應(yīng)位點(diǎn)后導(dǎo)致其突變，基因型判斷標(biāo)準(zhǔn)(見表4)：KO引物Trib3-seq-F1的PCR產(chǎn)物長度為333 bp，WT引物Trib3-seq-F2的PCR產(chǎn)物將消失的為純合子大鼠(Trib3-/-)；KO引物Trib3-seq-F1擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 498 bp，WT引物Trib3-seq-F2的PCR產(chǎn)物長度為523為野生型大鼠(Trib3+/+)；KO引物Trib3-seq-F1擴(kuò)增產(chǎn)物長度為333 bp，并且WT引物Trib3-seq-F2的PCR產(chǎn)物長度為523為雜合型大鼠(Trib3-/+)。F2代大鼠1～6是10166♂× 10159♀所生；F2代大鼠7～13是10179♂×10167♀所生(見表5)。鑒定結(jié)果結(jié)果：F2代中5號、9號、10號、11號、12號大鼠為純合型大鼠(見圖7～9)。

表4 基因型判斷標(biāo)準(zhǔn)

表5 F2代基因敲除大鼠出生情況

3 討論

Trib3基因可能與很多疾病相關(guān)，例如該基因過表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)元死亡，沉默TRIB3可抑制神經(jīng)元PC12細(xì)胞的死亡[16]。TRIB3沉默促進(jìn)缺氧缺血后的海馬神經(jīng)元增殖、抑制細(xì)胞凋亡[17]，TRIB3介導(dǎo)的抑制AKT促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，從而誘發(fā)癲癇發(fā)作[18]。此外，沉默TRIB3可能為減輕動脈粥樣硬化疾病提供一種新的治療方向[19]。TRIB3在卵巢癌組織中過表達(dá)和卵巢癌預(yù)后不良有關(guān)，TRIB3可能通過激活MEK/ERK信號通路促進(jìn)卵巢癌的惡性行為[20]。Trib3表達(dá)上調(diào)可能會促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)骨形成，因此Trib3在成骨形成過程中起重要作用。

傳統(tǒng)的動物模型受到物種、環(huán)境、時間等諸多因素的影響，基因敲除動物模型的建立為研究人類基因提供嶄新的方法。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)相對成熟,能夠精確修飾基因組。人們可以對一些結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的細(xì)胞基因組進(jìn)行定點(diǎn)、定量的改變，從而達(dá)到研究目的，簡言之，就是定向地改變實(shí)驗(yàn)對象的遺傳結(jié)構(gòu)和特征。被改造過的基因是可以隨染色體DNA復(fù)制而穩(wěn)定遺傳，而且所表達(dá)出來的性狀是可以穩(wěn)定遺傳的?；蚯贸Ｐ偷慕⒃诨蚬δ艿难芯颗c臨床醫(yī)療的應(yīng)用中具有重要意義。目前，Trib3基因與生殖相關(guān)方面的內(nèi)容以及Trib3基因敲除大鼠模型的建立鮮有報道，因此，Trib3基因敲除大鼠模型有利于探究Trib3在生殖過程中的作用，對其他致病機(jī)制的研究及治療藥物的篩選具有重要意義。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向敲除wistar大鼠Trib3基因第3外顯子，大鼠Trib3基因特異sgRNA(single-guide RNA)介導(dǎo)Cas9核酸酶切割DNA出現(xiàn)特定的DSBs(Double-Stranded Breaks)，在剪接體Trib3-201的3號外顯子的上游及下游切口，通過NHEJ(Non-homologous end Joining)修復(fù)途徑將2個切口直接連接，同時刪除兩個切口之間的序列(即3號外顯子)。Trib3基因的3號外顯子長度293 bp，非3的整數(shù)倍，刪除后將造成后續(xù)編碼區(qū)移碼突變，導(dǎo)致Trib3基因功能喪失。本研究首次建立純合型Trib3-/-大鼠模型。觀察發(fā)現(xiàn)Trib3基因敲除大鼠不具有胚胎致死性，敲除Trib3基因大鼠仍具有生育能力。該研究成功建立穩(wěn)定遺傳的 Trib3基因敲除大鼠模型并為探究Trib3基因功能提供理想的動物模型。接下來的工作我們將檢測精子發(fā)生中的標(biāo)記性基因表達(dá)水平，探究Trib3基因?qū)π坌源笫笊潮硇偷挠绊?，同時監(jiān)測激素水平的變化，建立體外大鼠睪丸組織細(xì)胞共培養(yǎng)體系，尋找該基因與精子發(fā)生相關(guān)的上下游信號通路，構(gòu)建完善的基因研究框架，進(jìn)一步闡明該基因在精子發(fā)生中的作用，為探究該基因與男性不育的相關(guān)關(guān)系奠定基礎(chǔ)。因此獲得穩(wěn)定遺傳的Trib3基因敲除大鼠是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的前提條件，基因敲除大鼠的基因型鑒定是后續(xù)工作的首要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟，同時，是保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性的必要條件。