王 嬌，鄒 琪，劉 成，楚新旭，汪華學(xué)

膿毒癥是指因感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，病人常常需要入住重癥醫(yī)學(xué)科加強(qiáng)監(jiān)護(hù)治療，需要多種臟器支持措施，醫(yī)療耗費(fèi)巨大，許多病人因缺乏有效救治而死亡[1-6]。在膿毒癥綜合治療措施中，尋找經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且具有確切治療效果的藥物成為臨床追求的目標(biāo)之一。已有的研究[6]表明靜脈輸注大劑量維生素C(Vit C)可以作為膿毒癥的輔助治療。Vit C作為一種常見的抗氧化劑，能清除氧自由基，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制凋亡，通過增加一氧化氮(NO)的生物利用度調(diào)節(jié)血流，具有一定程度的抗炎、抗氧化及增強(qiáng)免疫的作用[7]。相關(guān)研究[8]證實(shí)，補(bǔ)充Vit C可以預(yù)防、治療呼吸道及全身感染。FISHER等通過雄性辛克萊豬的實(shí)驗(yàn)證明了Vit C對(duì)膿毒癥具有抗炎作用，Vit C對(duì)膿毒癥的抗炎作用機(jī)制與miRNA表達(dá)變化可能存在一定的關(guān)系[9-12]；另有研究[13]顯示Vit C沒有顯著改善膿毒癥器官功能障礙評(píng)分和改善炎癥和血管損傷標(biāo)志物的作用。目前，Vit C對(duì)膿毒癥的臨床療效尚不確切。應(yīng)用Vit C后，膿毒癥病人血漿miR126水平顯著增高；而在膿毒癥小鼠血漿miR155水平顯著增高[11-12]，其機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過制作膿毒癥小鼠模型，探討Vit C對(duì)膿毒癥肺臟組織的影響及其潛在的作用機(jī)制，為臨床治療膿毒癥提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)BALB-C小鼠(許可證號(hào)SCXK(魯)20190003)18只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自合肥蜀山公司。均飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度20 ℃，光照12 h，自由飲食和喝水，飼養(yǎng)4～6周后進(jìn)行研究。流程遵照蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)指定的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用和護(hù)理指南進(jìn)行。將飼養(yǎng)4～6周的雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(CON)組、膿毒癥(SEP)組和干預(yù)(SEP+IR)組，每組6只。實(shí)驗(yàn)開始前3 d，SEP+IR組接受連續(xù)3 d靜脈注射Vit C(1 000 mg/kg)[14]，CON組和SEP組則接受連續(xù)3 d靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。3 d后采用盲腸穿刺結(jié)扎法，制作SEP組和SEP+IR組膿毒癥模型，CON組腹腔打開后未穿刺結(jié)扎直接縫合，分別留取肺組織標(biāo)本保存12 h。

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)檢查 取左肺使用預(yù)冷的 PBS洗滌完全，用濾紙盡可能吸除多余水分，稱量濕重(W)。用溫箱在80 ℃條件下干燥48 h后稱量干重(D)，計(jì)算W/D；另取右肺洗滌后用4%組織固定液浸泡固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，環(huán)保型透明液進(jìn)行透明，不同熔點(diǎn)蠟進(jìn)行浸蠟和包埋，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺臟組織學(xué)變化情況，另留取相關(guān)標(biāo)本-80 ℃凍存待測(cè)。

1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)肺組織miR126a-5p、miR155-5p的表達(dá) 在冰上研磨提取小鼠組織加入Trizol試劑，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并用2-△△CT法計(jì)算miR126a-5p、miR155-5p相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃10 min，變性95 ℃10 s，退火58 ℃20 s，延伸72 ℃10 s，引物miR126a-5p：F(5′-3′)CCG GGC GCA TTA TTA CTT TTG GTA CGC G，miR155-5p：F(5′-3′)CCG GGC GTT AAT GCT AAT TGT GAT AGG GGT。

1.2.3 免疫蛋白印記法(Western blotting)檢測(cè)Caspase 1及Caspase 3蛋白表達(dá)情況 取各實(shí)驗(yàn)組小鼠約0.1 g肺組織勻漿提取上清液并加入RIPA和蛋白抑制劑，應(yīng)用BCA試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進(jìn)行電泳，使用濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用脫脂牛奶完成封閉，孵育一抗至第2天，加入二抗，曝光，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算 Caspas-1、Caspase 3及Caspase 1/β-actin及Caspase 3/β-actin蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.2.4 IL-6、TNF-α的酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè) 取冰凍肺組織解凍后應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6，TNF-α，取肺組織以1∶10的比例加入PBS進(jìn)行勻漿，4 ℃12 000 r/min，離心20 min，收集上清液，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)差異 與CON組相比，SEP組W/D明顯增加，肺泡孔徑明顯減??；與SEP組相比，SEP+IR組W/D降低，肺泡孔徑增大(P<0.05)(見表1、2)。

表1 3組小鼠左肺質(zhì)量比較

表2 3組肺組織的肺泡孔徑

2.2 RT-qPCR檢測(cè)對(duì)膿毒癥小鼠肺組織的miR155-5p和miR126a-5p的表達(dá) 3組miR155-5p和miR126a-5p含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與SEP組相比，CON組和SEP+IR組miR155-5p和miR126a-5p含量均低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表3 3組肺組織miR155-5p、miR126a-5p的表達(dá)情況

2.3 Western blotting檢測(cè)膿毒癥小鼠肺組織Caspase 1、Caspase 3蛋白的表達(dá) 3組Caspase 1、Caspase 3蛋白含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)；與CON組相比，SEP組、SEP+IR組Caspase 1、Caspase 3蛋白含量均升高；與SEP組相比，SEP+IR組Caspase 1、Caspase 3蛋白含量減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4)。

表4 3組肺組織Caspase 1和Caspase 3蛋白的表達(dá)情況

2.4 ELISA法檢測(cè)肺組織促炎因子IL-6和TNF-α的表達(dá) 與CON組相比，SEP組和SEP+IR組肺組織IL-6、TNF-α含量均升高；與SEP組相比，SEP+IR組肺組織IL-6、TNF-α含量均減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表5)。

表5 3組肺組織的IL-6及TNF-α表達(dá)

3 討論

膿毒癥是感染導(dǎo)致的宿主體內(nèi)平衡失調(diào)，內(nèi)皮功能障礙和實(shí)質(zhì)細(xì)胞失調(diào)引起的新陳代謝失衡而引起的危及生命的器官功能障礙，常常存在免疫失調(diào)和炎癥因子風(fēng)暴[15]。宿主對(duì)感染的失調(diào)反應(yīng)，以及急性多器官結(jié)構(gòu)功能障礙與膿毒癥的高死亡率相關(guān)，其中呼吸、循環(huán)及免疫系統(tǒng)異常最為常見[16-17]。自2004年拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)(SSC)發(fā)布了第一版指南以來，盡管膿毒癥的治療取得了很大進(jìn)展，但病死率仍居高不下[18]。其核心問題在于關(guān)于膿毒癥的炎癥反應(yīng)控制仍然是一個(gè)棘手問題。尋找恰當(dāng)?shù)目刂蒲装Y反應(yīng)的藥物是各國(guó)學(xué)者孜孜不倦的追求目標(biāo)。眾所周知，Vit C是重要的內(nèi)源性抗氧化劑。已有病理研究證明，流感病人Vit C缺乏，肺部感染易惡化加重[19]，提示Vit C有抑制炎癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Vit C具有抗炎作用并影響Caspase 3的表達(dá)，顯著降低膿毒癥相關(guān)心肌Caspase 3和Caspase-8的升高，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的攝取和清除，抑制壞死(包括網(wǎng)狀病)，提示其抗炎作用與caspase通路相關(guān)[8,19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Vit C干預(yù)后，膿毒癥小鼠肺組織異常結(jié)構(gòu)得到改善，炎癥異?；罨艿揭种?。而我們團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)miR126在炎癥過程中通過Caspase信號(hào)通路調(diào)控淋巴細(xì)胞凋亡[21]。膿毒癥及miRNA與凋亡有一定的關(guān)系[22-24]，這一點(diǎn)在本研究中亦有發(fā)現(xiàn)。與對(duì)照組相比，膿毒癥組小鼠肺組織W/D比值增加，明顯的肺泡萎陷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且膿毒癥小鼠炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)明顯升高。而在應(yīng)用Vit C干預(yù)后，膿毒癥小鼠肺組織結(jié)構(gòu)異常和功能障礙得到改善，炎癥異常激活受到抑制，表明Vit C具有穩(wěn)定肺泡結(jié)構(gòu)及抑制異常炎癥活化作用。

Caspase是介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的重要媒介，其在誘導(dǎo)細(xì)胞特異性死亡的同時(shí)還具有活化炎癥介質(zhì)等多種功能。以Caspase 1為例，它是許多細(xì)胞對(duì)應(yīng)激活炎癥反應(yīng)的中心，通過形成NLRP-ASC-Caspase炎癥體復(fù)合物對(duì)病原體和內(nèi)源性介質(zhì)作出反應(yīng)而被激活，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18裂解成活性形式[25]。Caspase 3是程序性細(xì)胞死亡的核心角色，負(fù)責(zé)滅活蛋白，保護(hù)活細(xì)胞免受凋亡。我們課題組前期發(fā)現(xiàn)miR126在炎癥過程中通過Caspase信號(hào)通路調(diào)控淋巴細(xì)胞凋亡[21];本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠肺組織Caspase 1和Caspase 3表達(dá)明顯升高，可能與Caspase 1和Caspase 3介導(dǎo)的炎癥活化及細(xì)胞程序性死亡相關(guān)，但應(yīng)用Vit C后有所改善。

miRNAs作為一種內(nèi)源性22 nt RNA，對(duì)機(jī)體多種重要生理功能發(fā)揮調(diào)控并在機(jī)體炎癥功能中扮演重要角色。相關(guān)研究[26-27]證實(shí)，miR155的表達(dá)與炎癥密切相關(guān)，膿毒癥病人的miR155水平明顯高于健康病人，并且與病人的炎癥程度及預(yù)后成正相關(guān)。本研究同樣觀察到類似情況，與對(duì)照組相比，膿毒癥組小鼠肺組Caspase 1、Caspase 3、miR126a-5p及miR155-5p表達(dá)均明顯升高，提示miRNAs與炎癥存在潛在性關(guān)系。此外，本研究還觀察到應(yīng)用Vit C干預(yù)后，膿毒癥的炎癥反應(yīng)減輕的同時(shí)伴有miR126a-5p及miR155-5p表達(dá)的降低，提示Vit C抑制Caspase 1和Caspase 3表達(dá)的同時(shí)還通過干預(yù)miR126a-5p及miR155-5p的表達(dá)來改善炎癥。

本研究還觀察到，應(yīng)用Vit C干預(yù)膿毒癥小鼠后，膿毒癥肺損傷有不同程度減輕，同時(shí)伴有miR126a-5p和miR155-5p蛋白、Caspase 1和Caspase 3蛋白以及IL-6、TNF-α表達(dá)降低，表明Vit C可能通過miR126a-5p和miR155-5p表達(dá)降低Caspase 1和Caspase 3活性，從而降低小鼠肺組織中IL-6和TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子的分泌，減輕肺部炎癥，起到肺保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠肺組織存在炎癥活化、炎癥介質(zhì)激活，以及miR126a-5p和miR155-5p、Caspase 1和Caspase 3表達(dá)增加，而Vit C對(duì)此有抑制作用。而Vit C是否是通過干預(yù)miRNA活性進(jìn)而影響Caspase及相關(guān)物質(zhì)的具體表達(dá)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。