張瑤心， 劉煜東， 陳 曦， 侯文倩， 連小琴， 王蘭金， 張 宇

(湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430305)

0 引 言

微生物污染會使食品質(zhì)量惡化，保質(zhì)期縮短，采用具有抗菌性能的材料包裝食物能夠有效抑制細(xì)菌生長、提高食品貨架期[1]。殼聚糖是自然界中含量豐富的天然多聚物，它不僅具有良好的生物可降解性、重金屬離子吸附能力，生物相容性強(qiáng)且無毒性，還對各類微生物具有廣泛的抗菌能力，可被制成粉末、珠、纖維和薄膜[2]，因此可作為防腐材料應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。將氧化鋅、氧化銀等無毒的無機(jī)納米粒子加入到殼聚糖中，能使抗菌材料在各方面的性能得到改善[4]。研究表明，加入ZnO后殼聚糖/ZnO復(fù)合材料的抗菌性能明顯增強(qiáng)[5-6]。此外，在殼聚糖復(fù)合材料中添加聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA），還能改善材料的親水性和耐污染性。

殼聚糖復(fù)合材料的抗菌性能對其應(yīng)用極為重要，然而由于抗菌劑和輔料的多樣性，很難用統(tǒng)一的測試方法來評價殼聚糖復(fù)合材料的抗菌效果。目前國內(nèi)外還沒有針對殼聚糖復(fù)合材料抗菌性能的通用的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，而且由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、測試條件的差異，測試的結(jié)果差別較大。目前可通過平板擴(kuò)散法[7]、搖瓶振蕩法[8]、貼膜法[9]、激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察法[10]來檢測復(fù)合材料的抗菌性能[11]。平板擴(kuò)散法是檢測復(fù)合材料抗菌性能最常用的方法，但只有金屬離子等可溶出的成分才能在固體或半固體培養(yǎng)基內(nèi)部擴(kuò)散，而且平板擴(kuò)散法產(chǎn)生的抑菌圈雖然直觀地顯示材料的抑菌性能，但靈敏度和準(zhǔn)確性較差；貼膜法需要在復(fù)合材料表面滴加菌液，作用一段時間后洗脫殘余細(xì)菌，觀察細(xì)菌數(shù)量的變化，由于抗菌材料對微生物的吸附程度不同，而且作用時間、溫度、濕度、洗脫條件都會導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生明顯差異，此方法的便捷性和準(zhǔn)確性均不理想。電鏡觀察法主要觀察供試菌接觸抗菌材料后所產(chǎn)生的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，直觀但無法進(jìn)行定量分析，而且需要昂貴的大型精密儀器，不僅操作難度大還無法對大批量樣品進(jìn)行檢測。搖瓶振蕩法是在菌液和抗菌材料一起振蕩培養(yǎng)后檢測活菌數(shù)量的變化，能檢測可溶和非溶出性抗菌材料，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好。搖瓶振蕩法中活菌數(shù)最常用平板菌落計(jì)數(shù)法來檢測，但該方法重復(fù)性和準(zhǔn)確性都較差，操作耗時長、易污染且無法大批量檢測樣品。此外，MTT法和CCK-8法也能在一定程度上反映活細(xì)菌的數(shù)量[12]?；罴?xì)胞中的脫氫酶將MTT還原為不溶于水的紫色結(jié)晶formazan甲臜，可被DMSO或異丙醇等有機(jī)溶劑溶解。CCK-8試劑中含有水溶性的 WST-8， 即 2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽），可被活細(xì)胞中的脫氫酶還原為水溶性的黃色甲臜。由于細(xì)菌中也存在脫氫酶，因此MTT法和CCK-8法也可用于測量菌液的細(xì)胞活力以評價藥物的殺菌能力，這兩種方法可利用96孔板和酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，方便快捷，靈敏性和重復(fù)性均較高，適用于大批量樣品的定量分析檢測。近些年來，周立剛課題組利用MTT法檢測了小檗堿和藍(lán)桉醇等植物抗菌成分的抑菌活性[13]，張揚(yáng)課題組利用MTT法和CCK-8法檢測了醫(yī)用抗菌不銹鋼材料的抗菌活性[12]，均獲得了較好效果。使用不同的檢測方法對同一種抗菌材料進(jìn)行檢測會得出不同的結(jié)果，因此需要根據(jù)抗菌材料的特性選擇合適的檢測方法[14]。

在本研究中，我們通過平板擴(kuò)散法和搖瓶振蕩殺菌法檢測了殼聚糖/PVA/ZnO復(fù)合膜對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌性能。對搖瓶振蕩殺菌的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用CCK-8法、MTT法和平板菌落計(jì)數(shù)法測量用復(fù)合膜處理前后的菌液，比較了這三種方法的靈敏性和準(zhǔn)確性。這項(xiàng)工作可建立一種快速有效地評價復(fù)合材料抗菌性能的檢測分析方法，為抗菌復(fù)合材料在食品、化妝品和污水處理等方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌 Escherichia coli (CCTCC AB 93154)、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(CCTCC AB 91093)和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(CCTCC AB 90008)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑

殼聚糖（脫乙酰度85%）購自山東萊州海利生物制品有限公司；納米ZnO顆粒(10～50 nm)購自阿法埃莎化學(xué)有限公司；聚乙烯醇PVA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；K2HPO4、KH2PO4、NaCl、NaOH、鹽酸和瓊脂粉等化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT)購自上海阿拉丁生化科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器

氣浴恒溫振蕩器（THZ-92B）：上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-5200PC）：上海元析儀器有限公司；連續(xù)光譜光吸收酶標(biāo)儀（Spectra Max Plus 384）：Molecular Devices公司。

1.1.4 培養(yǎng)基及溶液

LB 培養(yǎng)基：NaCl 10 g，酵母粉 5 g，蛋白胨 10 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0。

MTT 溶液：稱取 50 mg MTT 粉末，用 10 mL PBS緩沖液溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖/PVA/ZnO 復(fù)合膜的制備

用8% 稀鹽酸溶解納米ZnO后，加入PVA粉末和殼聚糖粉末混合均勻，在密煉機(jī)中于90 ℃反應(yīng) 15 min，再放入模具中，在 40 MPa的壓力下 90 ℃熱壓5 min，然后通過水冷卻將溫度冷卻到室溫脫模取出即可得到殼聚糖/ PVA /ZnO復(fù)合膜(CPZ膜)。以數(shù)字1，3，5表示ZnO的質(zhì)量占ZnO和殼聚糖總質(zhì)量的百分比。作為對照，不加入ZnO，殼聚糖和PVA直接與8%的稀鹽酸混合制備的復(fù)合膜，簡稱CP膜。樣品名稱及具體配方見表1。

表1 殼聚糖/PVA/ZnO復(fù)合膜樣品制備配方及樣品名稱

1.2.2 MTT 法、CCK-8法和比濁法對不同濃度菌液的測量

將活化后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌液以5%接種量接入LB培養(yǎng)基，在180 r/min、37℃ 條件下振蕩培養(yǎng) 3 h至對數(shù)生長期。通過平板菌落計(jì)數(shù)法檢測菌液濃度，再將菌液進(jìn)行倍比稀釋，用MTT法和CCK-8法檢測菌液的細(xì)胞活力，并測量菌液在600 nm處的吸光值。根據(jù)菌液濃度分別與MTT法和CCK-8法所得數(shù)值，以及菌液光吸收值OD600繪制曲線，確定各曲線的線性范圍。

平板菌落計(jì)數(shù)法：用滅菌生理鹽水對菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后分別取各稀釋度的菌液100 μL，加入LB固體培養(yǎng)基平板，涂布平板，37 ℃培養(yǎng)12 h后數(shù)菌落數(shù)。

MTT 法：取100 μL 菌液至96孔板中，加入20 μL MTT 溶液，混勻后于 37℃ 靜置反應(yīng) 2 h。4000 r/min離心15 min并棄去上清，向沉淀中加入 100 μL DMSO并混勻，然后用酶標(biāo)儀檢測樣品在490 nm和630 nm處的吸光值，計(jì)算其差值。

CCK-8法：取 100 μL菌液至 96孔板中，加入10 μL CCK-8試劑，混勻后于 37℃ 靜置反應(yīng) 1 h，用酶標(biāo)儀檢測樣品在450 nm處的吸光值。

1.2.3 平板擴(kuò)散法

將含有0.3%瓊脂粉的LB半固體培養(yǎng)基加熱融化后，分別與3種供試菌的菌液（枯草芽孢桿菌106cfu/mL，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 107cfu/mL）以1000∶1的比例混合均勻后倒平板。將直徑4.5 mm的CP和CPZ膜圓片經(jīng)紫外線照射除菌后，分別貼在混有3種供試菌的半固體LB平板上，在4 ℃靜置 12 h 后，再于 37 ℃ 培養(yǎng) 24 h，最后測量抑菌圈和溶脹圈的直徑。

1.2.4 溫度，轉(zhuǎn)速對細(xì)菌生長的影響

將活化后的3種供試菌菌液，以5%接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，在180 r/min、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)3 h至OD600≈1.0。將3種菌液用滅菌的1%NaCl溶液稀釋10倍后，分別在轉(zhuǎn)速為120 r/min和 240 r/min，溫度為 25℃ 和 35 ℃ 條件下振蕩培養(yǎng)3 h，分別用MTT法和CCK-8法檢測菌液的細(xì)胞活力，并測量菌液的光吸收值OD600。以振蕩培養(yǎng)前的光吸收值OD600或細(xì)胞活力作為百分之百，計(jì)算振蕩培養(yǎng)后菌液的增長率，選取三種供試菌增長率最低的培養(yǎng)條件進(jìn)行后面的搖瓶振蕩殺菌法測定復(fù)合膜殺菌能力。

1.2.5 搖瓶振蕩檢測抗菌膜的殺菌能力

將活化后的3種供試菌菌液，以5%接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，在180 r/min、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng) 3 h 至 OD600≈1.0。用滅菌后的 1%NaCl溶液將菌液稀釋10倍后，取10 mL菌液和0.03 g復(fù)合膜一起加入錐瓶，對照組不加復(fù)合膜。將錐瓶在恒溫氣浴振蕩器中按照前面實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化的溫度和轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3 h，分別用CCK-8法、MTT和平板菌落計(jì)數(shù)法檢測菌液，以不加膜對照組的活菌數(shù)量或細(xì)胞活力作為百分之百，計(jì)數(shù)殺菌率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式顯示，并用Graphpad軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 平板擴(kuò)散法檢測抗菌膜的抑菌能力

復(fù)合材料中可溶成分的擴(kuò)散范圍隨著培養(yǎng)基中瓊脂濃度的增加而減小，因此我們選用在瓊脂粉含量為0.3%的半固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板擴(kuò)散法。圖1和表2結(jié)果表明，復(fù)合膜都有不同程度的溶脹，其中CP膜的溶脹最明顯，CPZ膜溶脹較少。這可能是由于制備復(fù)合膜的過程中鹽酸會將殼聚糖部分水解導(dǎo)致復(fù)合膜遇水溶脹，而ZnO消耗了部分鹽酸，減少了殼聚糖的水解，導(dǎo)致CPZ膜的溶脹減弱。

圖1 CP和CPZ膜對大腸桿菌（a）、金黃色葡萄球菌（b）和枯草芽孢桿菌（c）的抑制

復(fù)合材料的溶脹會增加可溶成分在培養(yǎng)基內(nèi)部的擴(kuò)散范圍，從而增大了抑菌圈直徑。為了更準(zhǔn)確地衡量復(fù)合膜的抑菌能力，我們測量了抑菌圈和溶脹圈的直徑，算出兩者的差值，即抑菌環(huán)的直徑。表2顯示，CPZ膜比CP膜對枯草芽孢桿菌的抑菌環(huán)大，且具有顯著性差異，但CP膜與CPZ膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)直徑無明顯差異。平板擴(kuò)散抑菌圈法作為檢測抑菌圈最常用的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，雖然能直觀展示抗菌材料的抑菌活性，但只能反映可溶組成的抑菌活性，靈敏度和準(zhǔn)確性均較差，很難準(zhǔn)確衡量CP及CPZ膜的抗菌效果。

表2 CP和CPZ膜的抑菌圈、溶脹圈和抑菌環(huán)直徑1)

2.2 比濁法、MTT法和CCK-8法對細(xì)菌濃度的測量

將3種細(xì)菌菌液進(jìn)行倍比稀釋，根據(jù)菌液濃度分別與MTT法和CCK-8法所得數(shù)值，以及菌液光吸收值OD600繪制曲線。圖2～圖4結(jié)果表明，隨著菌液濃度增加，菌液的光吸收值OD600，以及MTT法和CCK-8法測得的數(shù)值增加。當(dāng)枯草芽孢桿菌的菌液濃度為 1.5×105～4.8×106cfu/mL，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌液濃度為1×106～5×107cfu/mL，為光吸收值OD600、MTT法和CCK-8法測定的線性范圍。因此本研究后續(xù)進(jìn)行搖瓶振蕩殺菌，以及培養(yǎng)條件優(yōu)化所用枯草芽孢桿菌的初始菌液濃度約為1×106cfu/mL，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的初始菌液濃度 1×107cfu/mL。

圖2 菌液濃度與 菌液渾濁度OD600之間的關(guān)系

圖3 菌液濃度與MTT法檢測結(jié)果之間的關(guān)系

圖4 菌液濃度與CCK-8法檢測結(jié)果之間的關(guān)系

2.3 搖瓶振蕩法細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

搖瓶振蕩法需保證菌液振蕩培養(yǎng)3 h后活菌數(shù)和總菌數(shù)均不發(fā)生明顯變化，以確保在該條件下進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)時對照組保持穩(wěn)定。3種供試菌在錐瓶中振蕩培養(yǎng)前后的比例見表3，由于培養(yǎng)基經(jīng)過10倍稀釋，E.coli在25 ℃和35 ℃條件下均無明顯增長。S. aureus和B. subtilis在35 ℃的生長速度均比 25 ℃ 快，而且都在 240 r/min 比 120 r/min 時生長更快。因此，采用25 ℃，120 r/min作為進(jìn)行搖瓶振蕩殺菌實(shí)驗(yàn)的條件。

表3 供試菌搖瓶振蕩培養(yǎng)前后的變化

2.4 搖瓶振蕩檢測抗菌膜的殺菌能力

3種細(xì)菌菌液與各復(fù)合膜在 25 ℃，120 r/min 一起振蕩培養(yǎng)3 h后，分別用CCK-8法、MTT法和平板菌落計(jì)數(shù)法檢測菌液并計(jì)算殺菌率。CCK-8法檢測結(jié)果如圖5所示，所有CPZ膜對S. aureus和B. subtilis的殺菌能力均明顯強(qiáng)于CP膜，差異極顯著(P<0.01)。然而CPZ膜對E.coli的殺菌率與CP差別不大。圖6表明，MTT法測得所有CPZ膜對3種供試菌的殺菌率均明顯高于CP膜，差異極顯著(P<0.01)，且數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差小，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較高。MTT法和CCK-8法檢測結(jié)果均表明各CPZ膜對S. aureus和B. subtilis的殺菌活性比E.coli的殺菌活性強(qiáng)，可能由于E.coli比S. aureus和B.subtilis對Zn的耐受能力更強(qiáng)。

圖5 CCK-8法檢測復(fù)合膜的殺菌活性

圖7表明，平板菌落計(jì)數(shù)法測出的CPZ1膜與CP膜對E.coli和B. subtilis的殺菌率差別不大，差異沒有顯著性(P>0.05)，而且大部分?jǐn)?shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差均較大，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較低。值得注意的是，平板菌落計(jì)數(shù)法測得的CPZ1和CPZ3膜對B.subtilis的殺菌率比它們對E.coli和S. aureus的殺菌率低，這與MTT法和CCK-8法以及平板抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有所矛盾。這可能是由于在不利條件下B. subtilis形成了芽孢，較難被Zn2+殺死，且芽孢中脫氫酶活性較低因此無法被MTT法和CCK-8法檢測，而平板菌落計(jì)數(shù)法無法分辨B. subtilis的營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢，兩者均可長出菌落。因此這3種方法檢測出的CPZ膜對B. subtilis的殺菌活性差異較大，應(yīng)避免選用會形成芽孢的細(xì)菌作為檢測殺菌活性的供試菌。

此外，加入復(fù)合膜后菌液的吸光值OD600并未發(fā)生明顯變化，主要是由于殼聚糖和Zn2+雖然殺死了部分供試菌，但并未使它們的細(xì)胞破裂，因此無法用比濁法測量復(fù)合膜的殺菌率。

2.5 方法比較及結(jié)果分析

本研究比較了平板擴(kuò)散法和搖瓶振蕩殺菌法對CP和CPZ復(fù)合膜抗菌性能的檢測。從原理上來說，平板擴(kuò)散法基于復(fù)合膜中的可溶抗菌成分在半固體或固體培養(yǎng)基中擴(kuò)散，抑制周圍微生物的生長，所形成的抑菌圈的大小只能反映可溶成分的抑菌活性，因此靈敏性差，只能作為定性檢測。搖瓶振蕩殺菌法則將菌液和抗菌材料在振蕩條件下直接接觸后檢測活菌數(shù)量的變化，能反映抗菌材料中的溶解和未釋放出的抗菌成分的殺菌活性，搖瓶振蕩法所適用的檢測范圍更廣。各種檢測方法的性能比較匯總見表4。

表4 各種抗菌性能檢測方法的比較

通過平板菌落計(jì)數(shù)法、MTT法和CCK-8法來檢測搖瓶振蕩實(shí)驗(yàn)中復(fù)合膜的殺菌能力，并進(jìn)行比較。平板菌落計(jì)數(shù)法是目前通用的活菌數(shù)測量技術(shù)方法，但需要在超凈臺中進(jìn)行無菌操作，不僅容易污染而且步驟繁瑣且耗時長，且標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，導(dǎo)致測試結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。MTT法和CCK-8法均是利用活細(xì)胞中脫氫酶的活性來間接反映菌液中活細(xì)菌數(shù)量，不需要進(jìn)行無菌操作，利用96孔酶標(biāo)版、多通道移液器和酶標(biāo)儀可進(jìn)行大批量樣品的定量分析檢測。MTT法和CCK-8法不僅方便快捷且耗時短，而且標(biāo)準(zhǔn)偏差小，靈敏性和準(zhǔn)確性均較高。其中，MTT法所形成的紫色結(jié)晶甲臜需要被DMSO溶解后才能測量吸光值，而CCK-8法所形成的可溶的黃色甲臜可直接測量，因此CCK-8法比MTT法操作更簡便，耗時更短。本研究中采用的MTT法通過測量產(chǎn)物的OD490，并減去OD630，減少了菌體本身對吸光值的影響，能更準(zhǔn)確地反應(yīng)菌液的細(xì)胞活力，測出的殺菌率更準(zhǔn)確。但MTT法和CCK-8法在應(yīng)用時的前提條件是假設(shè)某種細(xì)菌單個菌體所含脫氫酶的活性不變，但細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件和生長階段的胞內(nèi)脫氫酶活性會有差異。因此在搖瓶振蕩法檢測復(fù)合膜殺菌活性時，要以不加復(fù)合膜但在相同條件下振蕩培養(yǎng)的對照組菌液的細(xì)胞活力作為百分之百，來計(jì)算殺菌率，才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上所述，相較于平板菌落計(jì)數(shù)法和CCK-8法，利用96孔板-MTT法檢測CP和CPZ復(fù)合膜在搖瓶殺菌能力具有操作簡單，客觀可靠，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

MTT法測定搖瓶振蕩殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZnO的加入增強(qiáng)了CPZ復(fù)合材料對三種供試菌的殺菌活性。研究表明，微生物細(xì)胞吸附的鋅離子導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜變形、細(xì)胞內(nèi)成分滲漏和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15-16]。E.coli、S. aureus和B. subtilis都是檢測材料抗菌能力時的常用菌種，但它們對金屬離子的敏感性有明顯差別。外膜的脂多糖層不僅能保持E.coli等革蘭氏陰性菌的結(jié)構(gòu)完整性，還能提高它們對重金屬毒性的耐受力[17]。此外，革蘭氏陰性菌所特有的RND家族外排系統(tǒng)可將胞內(nèi)和周質(zhì)空間中過量的Zn2+運(yùn)輸?shù)桨鈁18-19]。所以CPZ膜對E.coli的抗菌效果均明顯弱于S. aureus和B. subtilis。

3 結(jié)束語

本課題利用平板擴(kuò)散法和搖瓶振蕩殺菌法檢測了CP和CPZ復(fù)合膜在抗菌性能方面的差異。平板擴(kuò)散法結(jié)果表明，CPZ膜比CP膜的抑菌活性強(qiáng)但差異不顯著，該方法的靈敏度較差，其結(jié)果僅能夠作為定性分析。另一方面，本研究用CCK-8法和MTT法檢測了不同濃度的3種供試菌菌液，兩者都具有較廣的線性范圍，然后對搖瓶振蕩法的溫度和振蕩速度進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化后的條件（25 ℃，120 r/min）下用CCK-8法、MTT法和平板菌落計(jì)數(shù)法檢測了CP和CPZ膜的殺菌活性。結(jié)果表明，與CCK-8法和平板菌落計(jì)數(shù)法相比，MTT法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性最高，MTT法所測得的CPZ膜對3種供試菌的殺菌活性均明顯高于CP膜，該方法適用于檢測CPZ復(fù)合膜對不同供試菌的殺菌率。因此，本研究建立了一種通過MTT法檢測殼聚糖/PVA/ZnO復(fù)合材料在搖瓶振蕩條件下的殺菌能力的檢測分析方法，不僅操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，定量能力顯著，而且能滿足批量分析要求，適用于各種復(fù)合材料抗菌性能的常規(guī)批量檢測。