孫夢迪，李春陽，劉松坡，李小明，徐 睿，蘭東鋒，代小方，張繼東

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

隨著工業(yè)社會的發(fā)展，不孕不育已經(jīng)成為全民健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,婚后1年患有不孕不育的夫婦占8%～12%，其中單由男方因素所致的不育占50%[1]。除男性生殖系統(tǒng)本身異常導(dǎo)致精子發(fā)生障礙之外，社會和環(huán)境因素同樣會造成男性不育[2-3]。因此明確男性不育的病因及發(fā)病機制對臨床治療男性不育具有重要意義。睪丸作為精子發(fā)生的重要場所，明確其發(fā)育過程能更好的幫助我們尋找精子發(fā)生異常的原因，從而解決男性不育。然而，機體睪丸發(fā)育及精子發(fā)生過程非常復(fù)雜，給相關(guān)研究帶來一定困難。近年來，類器官、睪丸體外研究模型的建立為明確生精小管形成和精子發(fā)生機制提供了諸多可能[4]。此外，我們前期研究中通過添加KSR在體外成功重構(gòu)出生精小管樣結(jié)構(gòu)[5]。支持細胞作為生精小管的主要細胞在1865年被意大利生物學(xué)家Enrico Sertoli首次報道。隨后對原代支持細胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其在維持生殖細胞存活及精子發(fā)生過程中扮演至關(guān)重要的角色[6]。因此，支持細胞體外培養(yǎng)可作為研究睪丸形成和精子發(fā)生的理想模型。

研究證實生精小管發(fā)育和精子發(fā)生受到激素、蛋白、生長因子以及信號通路等因素的相互調(diào)控[7-9]。TGFβ信號通路相關(guān)分子可參與調(diào)控胚胎期睪丸的形成及生殖細胞的增殖及分化[10]。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β-ALK5信號軸參與體外睪丸生精小管重構(gòu)，促進CD34+內(nèi)皮細胞、p75+細胞、管周肌樣細胞(Peritubular myoid cells，PTMs)和SCs的增殖及SCs和其他睪丸細胞的遷移[11]。DHH/PTCH1信號軸通過上調(diào)PTCH1+細胞中類固醇生長因子1(Steroidogenic Factor 1，SF1)的表達促進胚胎睪丸間質(zhì)細胞的分化[12]以及Notch可通過下調(diào)支持細胞膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF )的表達來調(diào)節(jié)生精細胞的增殖和分化狀態(tài)，從而維持精原干細胞穩(wěn)態(tài)等[13]。即便如此，參與生精小管形成及精子發(fā)生過程中的大量調(diào)控因子及其機制仍有待進一步明確。Rho/ROCK信號通路廣泛存在于生物體內(nèi)，發(fā)揮促進細胞增殖、遷移、細胞骨架重塑等作用[14]。在胚胎發(fā)育早期用Y27632抑制ROCK后，小鼠心臟、神經(jīng)、軀體等出現(xiàn)明顯發(fā)育缺陷，表明Rho/ROCK信號通路還可參與器官發(fā)育[15]。在睪丸組織中，與生殖細胞相比，RhoA、Rac1在支持細胞呈高表達[16]。Limanjaya等[17]報道L-選擇素通過L-型Ca2+通道誘導(dǎo)Ca2+流入支持細胞內(nèi)活化RhoA、Rac1蛋白，從而調(diào)節(jié)細胞骨架和支持細胞間的緊密連接。在對生殖系統(tǒng)相關(guān)毒性研究中發(fā)現(xiàn)，雷公藤通過抑制支持細胞中Rho、ROCK蛋白的表達破壞支持細胞與生殖細胞間的緊密連接[18]。但Rho/ROCK信號通路在睪丸形成過程中的具體作用機制亟需進一步探討。本研究旨在建立體外生精小管培養(yǎng)模型，探討Rho/ROCK信號通路在調(diào)控生精小管形成中的作用，為男性不育癥的發(fā)病機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；體視顯微鏡(南通晶銳光學(xué)電子有限公司)；3111型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；IX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；DM2500熒光顯微鏡(德國Leica公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、KSR(美國Gbico公司)；IV型膠原蛋白酶(美國Worthington公司)；透明質(zhì)酸酶(德國Merck公司)；I型膠原蛋白(日本新田明膠株式會社)；4%多聚甲醛、Percoll細胞分離液、青鏈霉素混合液、24孔板爬片(北京索萊寶科技有限公司)；SOX-9多克隆抗體、DAPI(德國Merck公司)；Alexa FluorTM594 donkey anti-mouse(美國Thermo-Invitrogen公司)； Y27632、BK(美國MCE公司)；六孔板(廣州海貍生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物 10日齡雄性C57/BL6小鼠由遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，《實驗動物生產(chǎn)許可證》許可證號為SYXK(黔)2021- 0002，按照遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物飼養(yǎng)管理條例，并經(jīng)過遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批，倫審[2019]2-089，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，人工控溫23℃， 12 h光照，12 h黑暗，自由飲水采食。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 RPMI 1640培養(yǎng)基作為對照組(cont組)、KSR組、FBS組、KSR+Y27632組 (5μM Y27632、10 μM Y27632、25 μM Y27632)及Bradykinin(BK)組,各組DMSO終濃度均為0.1%。

1.3.2 小鼠睪丸支持細胞分離及培養(yǎng) 取新生10日齡小鼠睪丸，去除白膜后，0.1% 膠原蛋白酶酶解消化30 min，靜置后去除包含有睪丸間質(zhì)細胞的上清，將剩余組織剪至約3 mm小塊后加入膠原蛋白酶和透明質(zhì)酸酶再次酶解消化1 h后吹打均勻，200目細胞尼龍網(wǎng)過濾得到單細胞懸液，將3 mL單細胞懸液以1∶1比例緩慢加入3 mL 30% Percoll細胞分離液上方，230 g離心10 min，吸取分層處細胞即為粗提支持細胞。將分離得到的支持細胞分為cont組、KSR組、FBS組、KSR+Y27632組、BK組均勻鋪于10%膠原蛋白上，放置在 37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6 d，前3 d每天換液去除生殖細胞。

1.3.3 免疫熒光鑒定支持細胞純度 將分離得到的支持細胞接種于24孔板爬片上，待其完全貼壁去除生殖細胞(約3 d)后取出爬片用4%多聚甲醛固定。參照參考文獻[19]方法進行免疫熒光染色。一抗稀釋濃度GATA4 1∶200，二抗稀釋濃度 1：200，Alexa FluorTM594 donkey anti-mouse 陽性為紅色；DAPI終濃度為5 μg/mL。利用Image J軟件對GATA4+DAPI+細胞數(shù)量進行計數(shù)。

1.3.4 生精小管形態(tài)觀察 相差顯微鏡下連續(xù)每天監(jiān)測各組支持細胞形態(tài)變化及生精小管形成情況。

2 結(jié)果

2.1 分離支持細胞的鑒定 GATA4是支持細胞標(biāo)志物，如圖1所示，GATA4+DAPI+支持細胞達90%以上，表明支持細胞粗分離成功。

A:分離提取10日齡小鼠睪丸支持細胞，GATA4(紅色)標(biāo)記支持細胞;B:DAPI(藍色)標(biāo)記細胞核;C:利用IF技術(shù)對細胞純度進行鑒定；×10。圖1 分離細胞中GATA4+ 細胞支持細胞的鑒定

2.2 原代SCs生精小管體外2D模型的構(gòu)建 將分離得到的細胞分為cont組、FBS組、KSR組，如圖2所示，可以觀察到在cont組中細細胞伸長呈梭形并具有方向性，朝向管腔，細胞與細胞之間相互連接呈管狀分布，但FBS組細胞僅僅變?yōu)殚L梭形，未有管狀結(jié)構(gòu)形成。以上結(jié)果說明生精小管2D培養(yǎng)模型構(gòu)建成功。

2.3 Rho/ROCK信號通路在生精小管形成過程中的作用 將分離得到的細胞分為cont組、KSR組、KSR+Y組。觀察到 KSR組有明顯管狀結(jié)構(gòu)形成，而添加ROCK分子抑制劑后，隨著抑制劑Y27632濃度的升高，管狀結(jié)構(gòu)逐漸崩解(見圖3)。

A、B：培養(yǎng)6 d時cont組和KSR組細胞形態(tài)；C、D、E：培養(yǎng)6 d后不同抑制劑濃度對生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響；黑色箭頭指向被破壞的生精小管樣結(jié)構(gòu)；×10。圖3 抑制劑Y27632對生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用

為了進一步明確管狀結(jié)構(gòu)的形成是否與Rho/ROCK信號通路相關(guān)，選用Rho蛋白激動劑BK進一步驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BK組細胞相較于對照組呈長梭形，并且細胞與細胞之間相互連接，呈現(xiàn)出類似于KSR組的管狀結(jié)構(gòu)(見圖4)。以上結(jié)果表明，在生精小管形成過程中，Rho/ROCK信號通路扮演著重要的角色。

A、B、C：培養(yǎng)6 d時cont組、KSR組、BK組細胞形態(tài)；黑色箭頭代表生精小管樣結(jié)構(gòu)；×10。圖4 激動劑BK對生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用

3 討論

支持細胞是雄性睪丸生精上皮的主要細胞，與睪丸間質(zhì)細胞和管周肌樣細胞共同構(gòu)成生精微環(huán)境維持精子發(fā)生。胚胎期生殖腺支持細胞數(shù)量的維持對啟動生精小管形成具有重要意義[20]。而在成年期，其作為“Nurse”細胞通過形成緊密連接、黏附連接等維持生殖細胞分化發(fā)育為精細胞[6]。有研究表明支持細胞是睪丸中一類重要的毒性作用靶細胞[21]。支持細胞體外重構(gòu)生精小管系統(tǒng)不僅為研究生精小管形成機制、體外重現(xiàn)精子發(fā)育過程提供一個很好的模型，還可成為研究生殖毒性的一種可靠模型。因此，在本研究中，將支持細胞分離，在體外構(gòu)建生精小管模型并探討能夠影響生精小管形成的因素。首先對分離出的細胞進行鑒定，免疫熒光結(jié)果顯示，分離所得的細胞中GATA4+DAPI+細胞占90%以上，說明支持細胞分離成功。據(jù)Hadley等[22]報道，在添加卵泡刺激素、表皮生長因子、胰島素等生長因子培養(yǎng)支持細胞時，將支持細胞鋪在人工合成基底膜(包含層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、巢蛋白等)上與普通培養(yǎng)相比，前者可維持支持細胞逐漸伸長呈柱狀形成索狀結(jié)構(gòu)并伴隨著雄激素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的分泌。但是以上培養(yǎng)系統(tǒng)所含營養(yǎng)成分眾多，不利于深入研究參與生精小管形成的影響因素。2017年，Zhang等[23]將分離得到的支持細胞置于基質(zhì)膠上，在添加KSR后同樣在體外重構(gòu)出管狀結(jié)構(gòu)。但基質(zhì)膠中同樣含有大量生長因子。為了避免多種營養(yǎng)物質(zhì)的干擾，采用無營養(yǎng)成分的I型膠原蛋白作為支架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，對照組細胞由最初的圓形貼壁變?yōu)椴灰?guī)則形，細胞數(shù)量并沒有隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。FBS組只觀察到細胞貼壁后逐漸伸長呈纖維狀，細胞大量增殖，無管狀結(jié)構(gòu)形成。有意思的是在添加KSR后，鏡下觀察到隨著培養(yǎng)時間的增加細胞逐漸伸長、聚集，隨后細胞與細胞相連、遷移并逐漸形成管狀結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果提示生精小管模型構(gòu)建成功，故我們推斷KSR中含有某些未知成分能夠促進生精小管形成。

Rho GTP酶(Rho GTPases)是1985年發(fā)現(xiàn)的Ras超家族中的一員，其主要成員有Rho，Rac和Cdc42三類，具有調(diào)節(jié)細胞遷移、細胞增殖以及細胞極性等功能。ROCK又稱Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil kinase,ROCK)，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是目前功能研究最為詳細的Rho下游效應(yīng)分子。ROCK有兩種異構(gòu)體ROCK1和ROCK2，其中ROCK1在非神經(jīng)組織(肝，肺，脾和睪丸)中廣泛表達，而ROCK2主要分布在腦，心臟和肌肉中。Rho GTP酶活化后激活下游分子ROCK，進而磷酸化ROCK下游底物肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain,MLC)、LIM激酶(LIM kinase，LIMK)、埃茲蛋白/根連蛋白/膜突蛋白(Ezrin/Radixin/Moesin,ERM)等通過調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架的重組調(diào)節(jié)細胞遷移、吞噬、收縮和粘附等作用[14]，體外研究發(fā)現(xiàn)ROCK分子抑制劑Y27632可抑制胚胎期小鼠心臟、神經(jīng)、軀體[15]、腎臟輸尿管[24]的形成。為了進一步明確Rho/ROCK信號通路在生精小管重構(gòu)過程中的作用，我們選用ROCK分子抑制劑Y-27632及Rho蛋白激動劑BK探討Rho/ROCK信號通路的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與KSR組相比，隨著抑制劑濃度的增加，生精小管結(jié)構(gòu)逐漸崩解，細胞由長梭形逐漸趨向于圓形。相反的是在添加BK后，細胞伸長、遷移并相互連接形成類似于KSR組的管狀結(jié)構(gòu)。以上研究表明Rho/ROCK信號通路在SCs參與的生精小管形成過程中具有重要作用。有研究報道，在Rac1、Cdc42敲除小鼠中睪丸重量下降，血睪屏障破壞，SCs極性消失，生殖細胞發(fā)育受阻，睪丸生精小管排列紊亂[25-26]。RhoB在睪丸SCs、間質(zhì)細胞及早期生殖細胞中表達，調(diào)節(jié)黏附連接的動態(tài)平衡[27]。Lui等[28]研究發(fā)現(xiàn)整合素可激活RhoB，活化ROCK/LIMK/Cofilin通路介導(dǎo)黏附連接解聚，促進生殖細胞進入近腔面參與生精過程。與RhoB GTPase介導(dǎo)的黏附連接調(diào)節(jié)機制不同，Cdc42通過與其效應(yīng)物如IQGAP1的相互作用參與調(diào)節(jié)E-鈣粘附素介導(dǎo)的支持細胞生殖細胞細胞間粘附，失活的Cdc42可擾亂細胞黏附功能[29]。這些研究提示Rho蛋白參與睪丸生精小管的形成。

睪丸生精小管形成過程涉及因素眾多，雖然體外模型研究日漸發(fā)展迅速，迄今為止，相關(guān)研究仍有眾多問題亟待解決，包括如何確保體外研究模型的真實客觀性；調(diào)節(jié)生精小管形成的基因、信號通路之間究竟如何聯(lián)系等。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了生精小管體外培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK信號通路參與生精小管重構(gòu)過程。但Rho和ROCK在體內(nèi)分布廣泛，涉及的生理病理功能復(fù)雜，與其他信號通路的相互作用尚未明確，在今后的研究中仍需進一步深入探索Rho/ROCK信號通路在生精小管重構(gòu)中的作用。