李 雪，黃 佩，徐艷朋，施曉琦，蔣學(xué)琴，李純莎，吳柳松，陳 艷，何志旭

(1.貴州省兒童醫(yī)院，遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 小兒內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.貴州省兒童醫(yī)院，遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 小兒外科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué)組織損傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 遵義 563099)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是骨髓造血干/祖細(xì)胞惡性疾病，5年生存率低于30%[1-2]。近年來，雖然AML的治療方案有很大改進(jìn)，臨床緩解率也得到了相應(yīng)的提高，卻依舊存在耐藥、復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡率高的問題[3-4]。因此，尋找其發(fā)病機(jī)制尤為重要。過氧化物酶增殖物激活型受體δ(Peroxisome-proliferator-activated receptorβ/δ,PPARD)屬于核受體轉(zhuǎn)錄因子[5]，在多種實(shí)體瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[6-7]。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions,JAK/STAT)信號通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程，可促進(jìn)包括AML在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道了在慢性淋巴細(xì)胞白血病 (Chronic lymphocytic leukemia,CLL)細(xì)胞中PPARD促進(jìn)STAT3的表達(dá)，而拮抗JAKs可抑制此過程[10]，說明PPARD與JAK-STAT信號通路存在一定聯(lián)系。AML中PPARD是否與JAK-STAT信號通路有關(guān)尚未見報(bào)道。本研究旨在探索PPARD在AML患者中的表達(dá)及意義，進(jìn)一步研究PPARD在AML細(xì)胞(THP-1)中是否可通過JAK-STAT信號通路發(fā)揮作用，為AML的靶向治療提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對象 收集2019年5月至 2021年4月就診遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院初次確診為 AML 的46例患者，其中女性20例,男性26例；中位年齡為 16(10～59)歲。診斷及治療依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的兒童急性髓細(xì)胞白血病診療建議和成人急性髓系白血病中國診療的方案[11-12]。選取非血液疾病患者為對照組，共17例，女10例，男7例，中位年齡 20(3～57)歲。取得家屬同意，收集骨髓標(biāo)本2～3 mL，-80℃保存，備用。該研究已通過了我院倫理委員會(huì)的審批。人急性髓系白血病細(xì)胞株THP-1由北京大學(xué)饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑及儀器 β-actin、PPARD、JAK2、STAT3基因引物均由生工生物有限公司合成；PPARD抑制劑(GSK3787)和激活劑(GW501516)購于MedChemExpress公司；PPARD抗體購于abcam公司；JAK2和STAT3抗體購于成都睿雅生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購買于America Gibco公司；胎牛血清購于Biological Industries公司；RT-qPCR實(shí)驗(yàn)耗材均購于TaKaRa 公司；SDS-PAGE配膠試劑盒購買于碧云天公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；雙色預(yù)染蛋白Marker、ECL顯影液均購自成都睿雅生物公司；CO2培養(yǎng)箱(型號：3110)購買于America Forma Scientific公司；TDGC2-0.5超凈工作臺(tái)購自上海先鋒電器廠；A-5082 酶標(biāo)儀購自TECAN公司；成像系統(tǒng)、CFX96 TMReal-Time PCR儀購買于America BIO-RAD公司。

1.3 THP-1細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 在37℃的水浴箱中將裝有THP-1細(xì)胞的凍存管完全解凍后，在生物安全柜中用移液管吸出細(xì)胞懸液，使用含10%的FBS和1%的青霉素、鏈霉素抗生素的1640培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再依據(jù)THP-1細(xì)胞的生長情況，酌情更換培養(yǎng)基和傳代。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 收集狀態(tài)良好且處于對數(shù)期的THP-1細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)約為5×104個(gè)/孔，GSK3787濃度梯度分別為0、0.1、1、5及10 μM，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，然后酶標(biāo)儀檢測波長設(shè)定為450 nm時(shí)的細(xì)胞OD值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。抑制率=[(對照組-實(shí)驗(yàn)組)/對照組-空白組]×100%。

1.5 RNA提取及RT-qPCR 收集AML患者及正常對照組骨髓細(xì)胞，未干預(yù)和GSK3787干預(yù)的THP-1細(xì)胞，按照TRIzol試劑的說明書提取細(xì)胞總RNA。按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成所需cDNA，-80℃凍存?zhèn)溆谩PARD、JAK2、STAT3基因及內(nèi)參基因(β-actin)的引物序列(見表1)。PCR反應(yīng)體系(cDNA 1 μL，上下引物各0.4 μL，熒光試劑：5 μL,補(bǔ)水至10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性(30 s)，95℃變性(5 s)，60℃退火(30 s)，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸(3 min)，PPARD、JAK2、STAT3 的mRNA相對表達(dá)量用2-ΔΔCT來表示，ΔCt=目的基因Ct值-管家基因β-actin Ct值，-ΔΔCT=目的標(biāo)本ΔCt-對照標(biāo)本ΔCt)。

表1 引物序列

1.6 Western Blot檢測蛋白水平 收集AML患者和對照組骨髓細(xì)胞；THP-1細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后分組，分為對照組，PPARD激活劑(GW501516)組和抑制劑(GSK3787)組，收集不同組的細(xì)胞，在低溫條件下提取細(xì)胞的總蛋白。用BCA法蛋白定量。每孔蛋白上樣60 μg，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1.5 h，TBST洗3次后孵一抗并在4℃下孵育至過夜，第2天用TBST再洗3次后孵二抗，在室溫下孵育1 h，之后曝光顯影，分析顯影后的蛋白灰度值用Image Lab軟件。目的蛋白的相對表達(dá)量用各組蛋白的灰度值與內(nèi)參的比值來表示。

2 結(jié)果

2.1 AML患者的PPARDmRNA表達(dá)情況 RT-qPCR檢測患者和對照組PPARDmRNA表達(dá),結(jié)果顯示：AML患者PPARDmRNA表達(dá)(0.772 9±0.484 0)低于對照組(1.260 8±0.865 1)，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.022) ,見圖1。

*：與對照組比較，P<0.05。 圖1 RT-qPCR檢測患者與正常對照組PPARD mRNA表達(dá)

2.2PPARDmRNA在AML患者中的意義 為表明PPARDmRNA的表達(dá)與AML患者各臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性，將納入本研究中的患者臨床指標(biāo)進(jìn)行分組，分為性別、年齡、外周血幼稚細(xì)胞數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)，骨髓幼稚細(xì)胞百分比、肝脾腫大、FAB分型組，對不同組別內(nèi)PPARD表達(dá)水平進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，PPARD與AML患者性別、年齡、FAB分型有關(guān)，其中男性患者高于女性，兒童高于成人，M2高于M4/5(P=0.029、0.044、0.014)，見表2。

表2 AML患者臨床資料分析

2.3 AML患者中PPARD蛋白的表達(dá)水平 Western blot檢測患者與對照組中PPARD蛋白的表達(dá)情況，并用軟件分析灰度值計(jì)算其表達(dá)量。結(jié)果顯示：AML患者PPARD蛋白表達(dá)(0.819 8±0.015 9)水平高于對照組(1.066 0±0.001 4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)，見圖2。

*:與對照組比較，P<0.05圖2 AML患者和對照組中PPARD蛋白表達(dá)

2.4PPARD抑制劑(GSK3787)對THP-1細(xì)胞增殖的影響 通過CCK8法檢測使用GSK3787在(0、0.1、1、5、10 μM)濃度作用THP-1細(xì)胞3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24、48、72 h)的增殖抑制情況，結(jié)果表明，GSK3787在1 μM濃度作用24 h對細(xì)胞增殖抑制作用最明顯(見圖3)；因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選1 μM為GSK3787的作用濃度，24 h為作用時(shí)間點(diǎn)。

圖3 各時(shí)間段GSK3787對THP-1細(xì)胞增殖的影響

2.5 GSK3787對THP-1細(xì)胞PPARD基因和蛋白水平的影響 結(jié)果顯示：與對照組比較，GSK3787組PPARDmRNA無明顯變化(P=0.161)，PPARD蛋白表達(dá)明顯降低(P=0.002)。表明GSK3787抑制PPARD表達(dá)成功(見圖4)。

**:與對照組比較，P<0.01；A：mRNA表達(dá)情況；B：蛋白表達(dá)情況。圖4 GSK3787處理后PPARD mRNA和蛋白表達(dá)

2.6 GSK3787作用THP-1細(xì)胞后對JAK2及STAT3基因及蛋白水平 結(jié)果顯示：與對照組比較，GSK3787組JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)均下調(diào)(P=0.029、0.042)，蛋白表達(dá)水平也明顯降低(P=0.017、0.004)。表明PPARD表達(dá)的下調(diào)會(huì)抑制JAK2、STAT3的表達(dá)(見圖5)。

*：與對照組比較，P<0.05; **:與對照組比較，P<0.01；A：mRNA表達(dá)情況；B：蛋白表達(dá)情況。圖5 GSK3787處理后JAK2、STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)

2.7PPARD激活劑(GW501516)作用THP-1細(xì)胞后對PPARD表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：與對照組相比，GW501516組PPARD蛋白表達(dá)上調(diào)(P=0.043)，表明GW501516促進(jìn)PPARD表達(dá)(見圖6)。

*：與對照組比較，P<0.05圖6 GW501516處理后PPARD蛋白表達(dá)

2.8 GW501516作用THP-1細(xì)胞后對JAK2及STAT3蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：與對照組相比，GW501516組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)均升高(P=0.013、0.034)，提示PPARD的上調(diào)會(huì)促進(jìn)JAK2、STAT3的表達(dá)(見圖7)。

*:與對照組比較，P<0.05圖7 GW501516處理后JAK2、STAT3蛋白表達(dá)

3 討論

隨著對AML的深入研究，發(fā)現(xiàn)許多潛在的生物學(xué)機(jī)制與其發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。本研究中的PPARD是一種以經(jīng)典域?yàn)樘卣鞯暮耸荏w，作為核轉(zhuǎn)錄因子參與正常細(xì)胞的分化、發(fā)育和代謝，與人體生長發(fā)育息息相關(guān)，在各種生理活動(dòng)中具有組織特異性[5,13-14]。PPARD在不同疾病中的作用和意義也存在差異，特別是在腫瘤疾病中[15-16]。PPARD高表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞的增殖，敲低PPARD則降低了細(xì)胞活力并增加細(xì)胞凋亡[7,17-19]。而另有研究發(fā)現(xiàn)，PPARD可抑制人前列腺癌細(xì)胞(DU145)的活性，減弱肝癌細(xì)胞(HepG2)增殖，增加其凋亡[20-21]。本課題組研究了AML與PPARD表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示，患者PPARD蛋白表達(dá)水平高于對照組，但PPARDmRNA表達(dá)卻低于對照組，推測PPARD在AML中的表達(dá)可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)制。Roche等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在人子宮頸癌細(xì)胞中PPARD也涉及到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。有研究表明，PPAR亞家族成員PPARD可與異二聚體結(jié)合形成復(fù)合物，這些復(fù)合物影響核受體與共調(diào)節(jié)因子的相互作用或改變?nèi)旧|(zhì)來調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄，觸發(fā)共加壓復(fù)合物的釋放和輔激活復(fù)合物與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)或ATP依賴的核小體重塑活性的募集，這些輔激活物復(fù)合物進(jìn)一步觸發(fā)組蛋白乙?；?、染色質(zhì)去濃縮和轉(zhuǎn)錄激活，這可能是導(dǎo)致PPARD基因蛋白表達(dá)增加的原因[23]。此外，在AML患者中，PPARDmRNA的表達(dá)水平結(jié)果為女性患者低于男性，成人患者低于兒童，M4/5型患者低于M2型，推測PPARD在AML中的表達(dá)可能與性別、年齡及FAB分型有關(guān)。

為了進(jìn)一步探索PPARD在AML中的作用，我們在細(xì)胞上進(jìn)行了相關(guān)的研究，結(jié)果顯示，使用PPARD抑制劑GSK3787后，THP-1細(xì)胞增殖受抑制，說明下調(diào)PPARD表達(dá)會(huì)抑制AML細(xì)胞THP-1的增殖，但抑制率并未出現(xiàn)濃度依賴性，即在0～1 μM間隨濃度增加抑制率升高，但在1～10 μM間隨濃度增加抑制率降低，推測在0～1 μM濃度是PPARD的特異性靶標(biāo)所致，而在1～10 μM濃度除了對PPARD本身的作用外還對其他靶標(biāo)起了作用，可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng)；或者對THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用存在量 - 效局限性[24]。但PPARD是通過何種作用途徑抑制THP-1細(xì)胞的增殖？有研究發(fā)現(xiàn)，在CLL中PPARD能促進(jìn)STAT3的表達(dá)，表明PPARD與JAK-STAT信號通路有關(guān)聯(lián)[10]。JAK - STAT信號通路參與了包括AML在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[25-26]。近年來，有研究認(rèn)為JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)途徑可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡，使用JAK2抑制劑能逆轉(zhuǎn)其作用；而STAT3也是難治復(fù)發(fā)性AML患者的潛在靶標(biāo)[27-28]；因此，抑制JAK2、STAT3可能成為AML的靶向治療方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在AML患者中STAT3基因?yàn)楦弑磉_(dá)，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，敲低STAT3后能顯著抑制THP-1的增殖和減少小鼠體內(nèi)成瘤[29-30]。為進(jìn)一步闡明PPARD是否通過 JAK2/STAT3 信號通路影響AML細(xì)胞THP-1的增殖，故本研究在激活PPARD后，JAK2、STAT3蛋白表達(dá)均上升；而抑制PPARD后，發(fā)現(xiàn)JAK2、STAT3的mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)，同時(shí)THP-1細(xì)胞增殖受抑，這提示PPARD可能通過抑制JAK2、STAT3的表達(dá)進(jìn)而抑制THP-1細(xì)胞的增殖。推測PPARD可能通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路在白血病細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，但PPARD是如何干預(yù)JAK2/STAT3信號通路有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，AML患者中PPARDmRNA低于對照組，蛋白水平高于對照組，抑制PPARD后，AML細(xì)胞增殖受到抑制，推測可能是通過下調(diào)JAK2/STAT3 信號通路來發(fā)揮作用。說明PPARD與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這有望成為臨床上治療AML的可能靶點(diǎn)。