(青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，山東 青島 266003)

扁平苔蘚(lichen planus, LP)是一種主要累及皮膚、黏膜的慢性炎性和免疫性疾病。LP典型皮膚損害表現(xiàn)為多角形紫紅色扁平丘疹、斑塊，上有白色網(wǎng)紋(Wickham紋)。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在LP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1-2]。miRNA作為一類小型內(nèi)源性非編碼RNA，在調(diào)節(jié)皮膚炎癥、角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及免疫系統(tǒng)的分化等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。miRNA可通過(guò)靶向調(diào)控mRNA的降解或翻譯來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)編碼蛋白基因的表達(dá)[5-6]。miR-203是miRNAs家族中重要成員，以往研究顯示，皮膚LP(CLP)患者皮損組織中miR-203呈低表達(dá)，但在口腔LP(OLP)黏膜組織和唾液中miR-203卻是呈高表達(dá)[7-9]。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)，miR-203是IL-22和IL-8的靶標(biāo)miRNA，而IL-22和IL-8是機(jī)體炎性反應(yīng)的重要遞質(zhì)[8，10]，但miR-203靶向調(diào)節(jié)IL-22、IL-8是否在CLP的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)CLP患者皮損組織和正常皮膚組織中miR-203及IL-22、IL-8的表達(dá)情況，探討其在CLP發(fā)病中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

選取 2019年5月—2020年5月我院皮膚科就診的40例CLP患者的皮損組織樣本(CLP組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)典型并經(jīng)病理組織學(xué)確診；②近3個(gè)月未使用過(guò)免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療；③非孕期及哺乳期。同時(shí)選取我院同期于美容外科行美容手術(shù)切除的40例正常健康者皮膚樣本作為對(duì)照(對(duì)照組)。CLP組患者男22例，女18例；年齡25～64歲，平均(46.43±11.53)歲。對(duì)照組男19例，女21例；年齡19～61歲，平均(43.30±12.98)歲。兩組年齡、性別和取材部位方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑及儀器

Mir-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis and TB Green試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、ELISA試劑盒(日本TaKaRa公司)，LightCycler 480儀(瑞士Roche 公司)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)皮膚組織中miR-203的表達(dá)

采用RNAiso plus試劑(日本TaKaRa公司)提取每一皮膚組織標(biāo)本總RNA，采用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度與純度，選取A260/A280在1.8～2.0的RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。采用Mir-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis and TB Green試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取組織總RNA 3.75 μL，mRQBuffer(2X) 5 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL，反應(yīng)體系共10 μL。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min終止反應(yīng)。用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒在LightCycler 480儀上進(jìn)行miR-203檢測(cè)。RT-qPCR反應(yīng)中miR-203引物(F：5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAG-3′，R：5′-GTATCAACGCAGAGTACTTT-3′)；U6引物(F：5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，R：5′-TGGAACGCTTACCGAATTTGCG-3′)

1.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)皮膚組織中IL-22和IL-8的表達(dá)

使用ELISA試劑盒檢測(cè)兩組皮膚組織樣本中IL-22及IL-8的表達(dá)水平，檢測(cè)流程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品吸光度值，計(jì)算樣本中IL-22及IL-8的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組皮膚組織中miR-203及IL-22、IL-8的表達(dá)水平比較

CLP組皮膚組織中miR-203、IL-22、IL-8表達(dá)水平分別為1.27±0.74、24.78±3.93、24.16±2.99，對(duì)照組分別為1.60±0.74、23.01±3.03、22.91±2.43，CLP組皮膚組織中miR-203的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(t=2.013，P<0.05)，IL-22和IL-8表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(t=-2.258、-2.048,P<0.05)。

2.2 CLP組皮膚組織中miR-203、IL-22以及IL-8表達(dá)水平間的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析顯示，CLP組皮膚組織中miR-203基因表達(dá)水平與IL-22、IL-8表達(dá)水平均呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.348、-0.361，P<0.05)，IL-22與IL-8表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.422，P<0.05)。見圖1。

3 討 論

異常表達(dá)的miRNAs可導(dǎo)致機(jī)體炎性細(xì)胞因子的持續(xù)性分泌，引發(fā)或加重機(jī)體的自身免疫性疾病[11]。miR-203被認(rèn)為是皮膚和角質(zhì)形成細(xì)胞的特異性miRNA，與皮膚中常見的慢性炎癥性疾病有關(guān)，在許多炎癥性疾病如銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血及組織中均異常表

A、B分別為miR-203與IL-22、IL-8表達(dá)水平的相關(guān)性，C：IL-22與IL-8表達(dá)水平的相關(guān)性

圖1 CLP組皮膚組織中miR-203、IL-22及IL-8表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析

Fig.1CorrelationbetweentheexpressionlevelsofmiR-203,IL-22,andIL-8inskintissueintheCLPgroup

達(dá)，可以通過(guò)作用于特定靶基因參與調(diào)控某些疾病的炎癥反應(yīng)[12-16]。在銀屑病皮損組織中，miR-203上調(diào)可以抑制靶蛋白細(xì)胞因子信號(hào)通路抑制因子3(SOCS-3)的表達(dá)，激活信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路，引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[17-18]。XU等[19]研究表明，miR-203通過(guò)對(duì)靶蛋白IL-1受體相關(guān)激酶4(IRAK4)負(fù)調(diào)控進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)的激活，發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，CLP組皮損組織中miR-203的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，提示低表達(dá)的miR-203可能通過(guò)作用于靶蛋白參與CLP的炎癥過(guò)程。SHEN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-203在OLP組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，分析原因可能為，CLP和OLP組織結(jié)構(gòu)不盡相同，所處的微環(huán)境亦不相同，與皮膚相比，口腔黏膜暴露于來(lái)自食物及不同于皮膚的細(xì)菌、病毒或真菌等的微生物環(huán)境中；此外，免疫熒光研究顯示，在CLP棘層和顆粒層中觀察到了LP特異抗原(LPSA)[20-21]。而OLP患者以及患有其他皮膚病的患者的棘層和顆粒層中卻無(wú)此物質(zhì)。這些抗原可能會(huì)干擾免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致同一種miRNA在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)出現(xiàn)完全相反的結(jié)果。

目前的生物信息學(xué)研究表明，IL-22和IL-8均是miR-203的靶蛋白。IL-22主要由固有免疫細(xì)胞以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞如Th1、Th17、Th22細(xì)胞產(chǎn)生[22]。在皮膚組織中IL-22主要作用于角質(zhì)形成細(xì)胞[23]，一方面，IL-22可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗炎因子，發(fā)揮保護(hù)作用。另外，IL-22還可以誘導(dǎo)多種炎癥遞質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而參與并放大炎癥反應(yīng)[24-25]。近年來(lái)，IL-22在LP發(fā)病中的作用成為研究熱點(diǎn)。DOMINGUES等[26]研究發(fā)現(xiàn)，激活Toll樣受體7/8(TLR7/8)或葡萄球菌腸毒素B(SEB)可以誘導(dǎo)LP患者的促炎性CD8+IL-22+T細(xì)胞數(shù)量增加。CHEN等[27]發(fā)現(xiàn)，IL-22和IL-23在CLP和OLP黏膜組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，并且OLP黏膜組織中IL-22和IL-23表達(dá)水平顯著高于CLP。IL-22是IL-23的下游效應(yīng)細(xì)胞因子。IL-22可以由Th22細(xì)胞以IL-23依賴的方式表達(dá)，在LP中介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞的損傷。本研究的結(jié)果顯示，CLP組皮膚損傷組織中IL-22的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)，提示其可能參與了CLP的致病過(guò)程。且因IL-22是Th22細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，提示CLP的致病過(guò)程可能與Th22細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)[28]。

IL-8是Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子，是宿主對(duì)損傷和炎癥反應(yīng)的重要遞質(zhì)，在慢性疾病中起主要作用，具有激活嗜中性粒細(xì)胞和趨化嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等多種功能[29-30]。IL-8已被證實(shí)在鼻咽癌細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞中受到miR-203的調(diào)控[31-32]。有研究結(jié)果顯示在糖尿病足潰瘍患者中miR-203可以直接靶向并且抑制IL-8的表達(dá)[10]。另外研究表明，IL-22可以增強(qiáng)炎癥性腸病中腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的IL-8的表達(dá)[33]。OLP患者的黏膜組織、唾液以及血清中均高表達(dá)IL-8，且其表達(dá)水平與OLP患者的臨床嚴(yán)重程度密切相關(guān)[34]。因此，推測(cè)IL-8可作為評(píng)估OLP臨床嚴(yán)重程度的可靠指標(biāo)。但是到目前為止，IL-8在CLP患者機(jī)體中是否表達(dá)及其表達(dá)水平的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，CLP組皮膚組織中IL-8的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，并且相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，miR-203的表達(dá)水平與潛在靶蛋白IL-22及IL-8的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，IL-22與IL-8表達(dá)水平之間呈顯著正相關(guān)，提示miR-203的異常表達(dá)可能導(dǎo)致IL-22、IL-8的表達(dá)上調(diào)。IL-22與IL-8相互協(xié)作共同誘導(dǎo)炎性細(xì)胞在炎癥部位聚集，放大炎癥反應(yīng)，形成真皮淺層淋巴細(xì)胞的帶狀浸潤(rùn)，促進(jìn)基底細(xì)胞液化變性與細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-203可能通過(guò)調(diào)控其下游靶蛋白IL-22、IL-8的異常表達(dá)參與CLP的形成過(guò)程，但具體機(jī)制還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest: All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL28770)。受試對(duì)象已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent: All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL28770). Consent letters have been signed by the research participants.

作者貢獻(xiàn)：路金明、王瑩瑩、王宗嶺參與了研究設(shè)計(jì)；楊培、王君、李媛媛參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions: The study was designed byLUJinming,WANGYingying, andWANGZongling. The manuscript was drafted and revised byYANGPei,WANGJun, andLIYuanyuan. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.