王中良，邢鵬濤，王金慧，劉蒙蒙

多發(fā)性骨髓瘤是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%，其特征為骨髓內(nèi)克隆漿細(xì)胞的異常擴(kuò)增[1-2]。多發(fā)性骨髓瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)異常提示其為一種異質(zhì)性疾病，對其進(jìn)行風(fēng)險評估和個體化治療在改善療效中起關(guān)鍵作用[3]。檢測骨髓瘤細(xì)胞可直接評估患者的病情，但需抽取患者骨髓，存在樣本獲取過程復(fù)雜、創(chuàng)傷大、骨髓液容易被稀釋和患者依從性較差等缺點(diǎn)[4]。文獻(xiàn)[5-6]顯示，多發(fā)性骨髓瘤患者外周血中可以檢測到循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞(CMCs)，且對患者預(yù)后具有重要的預(yù)測價值。而目前CMCs水平是否可以反映多發(fā)性骨髓瘤患者的病情并對分期進(jìn)行預(yù)測的研究還較少。本研究收集2017年1月～2020年5月在我院接受治療的72例多發(fā)性骨髓瘤患者資料，分析CMCs水平與多發(fā)性骨髓瘤疾病進(jìn)展指標(biāo)的相關(guān)性，并通過ROC曲線檢測CMCs水平預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤分期的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料納入標(biāo)準(zhǔn)：① 符合“中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)”[7]；② 初次診斷為多發(fā)性骨髓瘤；③ 未經(jīng)過相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；② 合并其他血液系統(tǒng)疾??；③ 伴肝、腎等重要器官功能衰竭；④ 合并嚴(yán)重感染。本研究納入72例，男41例，女31例，年齡51～73(62.8±9.4)歲。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病灶定義的標(biāo)準(zhǔn)，將外周血中CMCs占單核細(xì)胞比值≥1×10-4定義為陽性(CMCs陽性組，40例)，<1×10-4定義為陰性(CMCs陰性組，32例)。收集的臨床資料：年齡,性別,多發(fā)性骨髓瘤的DS分期、ISS分期以及免疫學(xué)分類，全自動生化分析儀檢測患者外周血中血紅蛋白(Hb)、白蛋白(ALB)、Ca2+、尿肌酐(Cr)、乳酸脫氫酶(LDH)和β2微球蛋白(β2MG)水平。所有患者及家屬對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.2 外周血中CMCs檢測收集患者治療前的外周血5 ml，通過Ficoll梯度分離外周血樣品中的單核細(xì)胞，然后加入CD19、CD38、CD45、CD138和熒光標(biāo)記的Kappa、Lambda游離輕鏈的抗體[8]。將單核細(xì)胞數(shù)調(diào)整至(5～10)×109/L，使用流式細(xì)胞儀(型號：FACS CANTO Ⅱ，BD公司)檢測外周血中CMCs(細(xì)胞表面CD19-、CD38+、CD45-、CD138+表達(dá))數(shù)量，所得結(jié)果采用萬分比表示。

1.3 免疫組化法檢測骨髓組織中Ki67表達(dá)情況留取患者入院時初次骨髓穿刺+活檢骨髓組織，置于裝有福爾馬林固定液的容器中，送至病理科進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，最終制成石蠟標(biāo)本。切成3～5 μm的薄片，放置恒溫箱(55～60 ℃)中烘烤2 h，取出后室溫下冷卻。梯度乙醇和去離子水浸泡，進(jìn)行脫蠟和水化，沖洗后放置于清水中待用。經(jīng)過抗原修復(fù)液處理，滴加一抗，放置恒溫箱(37 ℃)中60 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，每次2 min。滴加二抗，在室溫下靜置20 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，每次2 min。滴加適量二氨基聯(lián)苯胺顯色劑，室溫下靜置15 min，用清水沖洗。蘇木精染液再次染色30 s，鹽酸水化，自來水沖洗后進(jìn)行脫水、透明、封片，最終在顯微鏡下觀察Ki67的表達(dá)情況，Ki67定位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核為棕褐色則表明Ki67表達(dá)為陽性，見圖1。

圖1 多發(fā)性骨髓瘤中Ki67的陽性表達(dá)(箭頭所示) SP×1 000

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較見表1。兩組年齡、性別、免疫學(xué)分類、ALB、Ca2+和LDH比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DS分期、ISS分期、Hb、Cr和β2MG兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組一般資料比較[例(%)]

2.2 Ki67在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)情況Ki67陽性細(xì)胞比例：CMCs陽性組為5.3%～40.7%(20.6%±12.5%)，顯著高于CMCs陰性組的0.5%～6.3%(2.8%±2.0%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.972，P<0.001)。

2.3 CMCs與疾病進(jìn)展指標(biāo)間的相關(guān)性分析見圖2。經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析，CMCs與ALB、Ca2+和LDH水平之間無相關(guān)性，與Hb水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.714，P<0.001)，與Cr水平呈正相關(guān)(r=0.693，P<0.001)，與β2MG水平呈正相關(guān)(r=0.765，P<0.001)，與Ki67陽性細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.756，P<0.001)。

圖2 CMCs與疾病進(jìn)展指標(biāo)間的相關(guān)性分析

2.4 CMCs對多發(fā)性骨髓瘤DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期的評估見圖3和表2。根據(jù)ROC曲線特征，CMCs對DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期均有一定的預(yù)測價值。

表2 CMCs評估DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期的ROC曲線特征

圖3 CMCs評估DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期的ROC曲線

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤的診斷主要基于骨髓中漿細(xì)胞數(shù)量、溶骨性骨破壞情況、貧血、高鈣血癥和慢性腎功能不全等指標(biāo)[9]。及時了解疾病進(jìn)展和危險分層對治療方案的選擇和患者預(yù)后均有一定幫助，但骨髓抽取難度大，患者依從性低。本研究通過收集多發(fā)性骨髓瘤患者外周血，檢測CMCs與多發(fā)性骨髓瘤疾病進(jìn)展指標(biāo)的相關(guān)性，并分析對多發(fā)性骨髓瘤患者分期的預(yù)測價值。

有研究[10]顯示，β2MG在多發(fā)性骨髓瘤中可反映腫瘤的負(fù)荷情況，并且是患者預(yù)后的重要指標(biāo)。Hb可以反映貧血程度，Cr反映腎功能損傷程度。本研究結(jié)果顯示，CMCs陽性組與陰性組DS分期、ISS分期、Hb、Cr和β2MG比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明外周血中CMCs水平與多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床分期、貧血程度及腎損傷程度具有一致性。經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析，CMCs水平與Hb水平呈負(fù)相關(guān)，與Cr和β2MG水平呈正相關(guān)。

Ki67是一種核蛋白，在G1、S、G2期和有絲分裂的細(xì)胞核中呈陽性表達(dá)[11]，且其表達(dá)狀況代表細(xì)胞的增殖狀態(tài)，可作為癌癥的預(yù)后標(biāo)志物[12-13]。本研究中，CMCs陽性組骨髓中Ki67陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于CMCs陰性組，說明CMCs陽性組中腫瘤細(xì)胞增殖較多。經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析顯示，CMCs陽性細(xì)胞數(shù)與Ki67陽性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，因此外周血中CMCs陽性細(xì)胞數(shù)水平可間接反映多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中腫瘤細(xì)胞的增殖情況。Wang et al[14]研究顯示，免疫磁珠聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)可提高外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)的檢測效率，用于監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤患者的微小殘留病變和復(fù)發(fā)情況。多發(fā)性骨髓瘤患者血液中存在循環(huán)漿細(xì)胞被認(rèn)為是高度增生性疾病的標(biāo)志，Granell et al[15]通過細(xì)胞學(xué)評估存在5%～20%的循環(huán)漿細(xì)胞與較差的總體存活率有關(guān)，且不受年齡、肌酐等因素的影響。Garcés et al[5]研究顯示，CTCs的基因表達(dá)與骨髓瘤細(xì)胞的基因表達(dá)高度相似，僅有55個基因表達(dá)存在差異，CTCs過度表達(dá)與炎癥、缺氧和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，CTCs的過度表達(dá)與患者的低生存率有關(guān)。另外CTCs的檢測在其他腫瘤中的應(yīng)用也較為廣泛，對肺癌的早期診斷和預(yù)后判斷均具有重要價值。Ilie et al[16]研究顯示，慢性阻塞性肺疾病中有5例患者外周血中檢測到CTCs，而胸部CT卻未發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)，在隨后的1～4年隨訪中相繼發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)，并診斷為Ia期肺癌。CTCs的計數(shù)和表型可以輔助判斷腫瘤的性質(zhì)及惡性程度，CTCs計數(shù)越多其臨床分期可能就越晚，這在一定程度上可指導(dǎo)臨床決策[17-19]。本研究顯示，CMCs對DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期均有一定預(yù)測價值。

綜上所述，CMCs與Hb呈負(fù)相關(guān)、與Cr、β2MG和Ki67陽性細(xì)胞比例呈正相關(guān)，對DS分期Ⅲ期和ISS分期Ⅲ期均有一定的預(yù)測價值，建議監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤患者檢測外周血中CMCs水平及時了解疾病進(jìn)展情況。