徐 夢(mèng)，陳婷婷，盧如劍，陳 宇，呂好平

（玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心/玉林中藥材（含香辛料）質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣西 玉林 537000）

隨著人們生活水平的不斷提高及性激素殘留研究的深入，動(dòng)物源性食品中的激素殘留已經(jīng)成為世界各國(guó)人民的關(guān)注焦點(diǎn)與討論話題［1，2］。國(guó)際明確禁止部分激素物質(zhì)在家禽家畜飼養(yǎng)中使用，同時(shí)規(guī)定動(dòng)物源性食品中不得檢出［3，4］，但依然存在濫用激素的情況，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中有激素殘留［5-7］。天然性激素屬于一類(lèi)具有脂溶性、分子質(zhì)量低的甾體激素，主要包括雌激素、孕激素和雄激素［8］。人工合成的性激素與天然性激素有相似的性質(zhì)和功能［9-11］。在人體正常分泌情況下，性激素對(duì)人的生理調(diào)節(jié)作用是有益的，但當(dāng)其濫用于動(dòng)物飼養(yǎng)時(shí)，性激素通過(guò)食物進(jìn)入人體并在體內(nèi)殘留、蓄積，會(huì)引起如兒童性早熟、內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，誘發(fā)癌癥、心血管疾病等問(wèn)題［12-15］。為了防止性激素在動(dòng)物飼養(yǎng)中的非法使用，保障人民的健康安全，性激素殘留的檢測(cè)技術(shù)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)［16-18］。因此，建立一種高效性、高靈敏度、多成分的檢測(cè)分析方法有重要的意義［19］?；谀壳熬哂懈哽`敏度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和可以減少基質(zhì)成分干擾的SPE 技術(shù)，本研究建立了提取、SPE 柱凈化、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中13 種性激素殘留的定性定量分析方法［20-22］。樣品經(jīng)甲酸乙腈提取，分別用具有高潔凈度、高重現(xiàn)性和保留特性獨(dú)特的Waters Oasis PRiME HLB 柱和X-HLB 柱進(jìn)行凈化，經(jīng)Agilent USDAB SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100.0 mm）色譜柱分離，采用正負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，外標(biāo)法定量，測(cè)定雞蛋中13 種性激素的殘留，以期建立高效的、快速的、多組分監(jiān)測(cè)及操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)分析方法，為雞蛋中性激素的檢測(cè)分析提供有效的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 1290－6460A 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有安捷倫1290 型超高壓液相色譜儀、安捷倫6460A 型三重四極桿質(zhì)譜儀配電噴霧離子源），美國(guó)Agilent 公司；3K15 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó) Sigma 實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司；固相萃取裝置；TTL-DCⅢ型氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技有限公司；541-10000-00-1 型渦旋振蕩器，德國(guó)海道爾夫公司；VXR B S25 型基本型振蕩器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；Easy 300H 型恒溫?cái)?shù)控超聲清洗器，德國(guó)艾爾瑪（Elma）儀器公司；冷柜，海爾集團(tuán)；Milli-Q 系列純水機(jī)，密理（Millipore）博中國(guó)有限公司；Waters Oasis PRiME HLB 柱，沃特世科技（上海）有限公司；Polyclean X-HLB 柱，廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司；電子天平、有機(jī)相型微孔濾膜（0.22 μm）、液相小瓶、移液槍、離心管、容量瓶、錐形瓶、量筒、燒杯等。

1.1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品 雌三醇（含量97.6%）、雌二醇（含量96.3%）、炔雌醇（含量99.4%）、雌酮（含量100.0%）、炔諾酮（含量99.4%）、己烯雌酚（含量99.5%）、黃體酮（含量99.6%）、醋酸甲羥孕酮（含量99.6%）、丙酸睪酮（含量99.8%），以上藥品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；睪丸酮（含量99.4%），BePure 公司；甲基睪丸酮（含量≥98%）、群勃龍（含量≥98%）、諾龍（含量≥98%），購(gòu)于Fint Standard 公司；乙腈、甲醇，均為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司；試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

1）標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備。分別精密稱(chēng)取雌三醇10.26 mg、雌二醇 10.41 mg、炔雌醇 10.07 mg、雌酮10.05 mg、炔諾酮10.06 mg、己烯雌酚10.08 mg、黃體酮10.03 mg、睪丸酮10.05 mg、甲基睪丸酮10.03 mg、群勃龍10.04 mg、醋酸甲羥孕酮10.06 mg、諾龍10.05 mg、丙酸睪酮10.04 mg，置于50.00 mL 容量瓶，加適量的甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成濃度200.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.50 mL 于100.00 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配成濃度1.00 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2 供試品溶液的制備

1）稱(chēng)取。稱(chēng)取樣品2.50 g 置于50.00 mL 離心管中，加入 2.00 mL 去離子水、8.00 mL 乙腈，渦旋振蕩提取1 min，再加入甲酸1.00 mL，渦旋振蕩提取1 min，超聲提取 10 min，4 000 r/min，4 ℃冷凍離心10 min，收集上清液，殘?jiān)尤?0.00 mL 乙腈重復(fù)提取1 次，合并上清液，用乙腈定容至20.00 mL，混勻待凈化。

2）凈化方法一。取待凈化液8.00 mL 分次轉(zhuǎn)移至PRiME HLB SPE 小柱中，在重力作用下自然流出洗脫，收集全部流出液，加入3.00 mL 乙腈洗脫，抽干柱子并收集流出液，氮吹至少于約1.00 mL，乙腈定容至2.00 mL，充分混勻，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

3）凈化方法二。取待凈化液8.00 mL 轉(zhuǎn)移至離心管中，氮吹至3.00 mL 左右，加入5.00 mL 去離子水，渦旋溶解，上X-HLB SPE 小柱（使用前依次用5.00 mL 甲醇、5.00 mL 去離子水活化）中，在重力作用下自然流出，棄去流出液，加入5.00 mL 去離子水洗離心管然后加入SPE 小柱，用5.00 mL 5%甲醇水（5.00 mL 甲醇+95.00 mL 去離子水），依次加入4.00 mL 甲醇、4.00 mL 乙腈洗脫，收集洗脫液，抽干柱子并收集流出液，氮吹至少于約1.00 mL，乙腈定容至2.00 mL，充分混勻，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.3 色譜及質(zhì)譜條件

1）色譜條件。色譜柱為Agilent USDAB SB-C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100.0 mm），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，流動(dòng)相A 為0.1%氨水，B 為乙腈，流速為0.3 mL/min，梯度程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子（ESI）源，正離子模式和負(fù)離子模式，分4 個(gè)時(shí)間段采集；用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為3 500 V，氣體溫度為300 ℃，氣流為5 L/min，化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表2 所示。

表2 13 種化合物的MRM 參數(shù)

1.2.4 定性測(cè)定 樣品檢測(cè)時(shí)，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品檢出的色譜峰保留時(shí)間（Rt）應(yīng)在±5%內(nèi)，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中所選擇的離子對(duì)（m/z）均出現(xiàn)，且3 對(duì)離子對(duì)豐度比和相近質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的離子豐度比一致，則可判定樣品中存在該成分［23，24］。

1.2.5 定量測(cè)定 將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別按儀器參考條件進(jìn)行測(cè)定，橫坐標(biāo)為濃度，縱坐標(biāo)為色譜峰的峰面積，繪制出基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將試樣溶液按儀器參考條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣測(cè)定溶液中待測(cè)組分的濃度，試樣待測(cè)液響應(yīng)值若低于定量限，應(yīng)視為未檢出，并且要求曲線相關(guān)系數(shù)大于0.990。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

由于被分析目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)差異大和極性范圍廣，將樣品性激素目標(biāo)物提取至有機(jī)溶劑中是分析需要解決的首要問(wèn)題［25，26］。雞蛋中水溶性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、氨基酸、磷脂）較多，乙腈作為極性較強(qiáng)的溶劑對(duì)大多數(shù)性激素都能有效提取，且油脂溶出率低，加入甲酸使得蛋白質(zhì)變性，達(dá)到減少蛋白質(zhì)溶出的目的，因此選用甲酸乙腈為提取溶劑［27，28］。

2.2 固相萃取柱的選擇

目前對(duì)樣品凈化的技術(shù)方法主要是固相萃取法，試驗(yàn)選擇了Oasis PRiME HLB 和Polyclean XHLB 固相萃取柱進(jìn)行凈化效果的比較［29，30］。結(jié)果表明，2 種萃取柱對(duì)13 種性激素的回收率結(jié)果有差異。

2.3 線性回歸方程和檢出限

分別精密吸取1.00 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.02、0.04、0.10、0.20、0.40、0.50 mL 置于 8.00 mL 空白基質(zhì)中，同供試品操作過(guò)SPE 柱子并吹至近干，定容至2.00 mL。按“1.2.3”色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定方法，13 種性激素離子對(duì)的MRM 色譜如圖1 所示。以進(jìn)樣濃度（x）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各自的回歸方程和線性范圍，用外標(biāo)法定量。以最低信噪比S/N=10 為原則，分別計(jì)算13 種激素的定量限（LOQ 值）。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，13 種性激素在其線性范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.990，線性良好。

表3 13 種性激素的回歸方程及線性范圍（n=7）

圖1 13 種性激素離子對(duì)的MRM 色譜

2.4 加標(biāo)回收和精密度

根據(jù)13 種性激素的線性范圍，在雞蛋空白樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，加入濃度分別為50.00、100.00、200.00 μg/kg，分別檢測(cè) 2 組和 6 組平行樣品。按“1.2.2”方法處理，根據(jù)“1.2.3”儀器方法進(jìn)行回收率測(cè)定，從而計(jì)算出13 種性激素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表4。在雞蛋中，采用 Oasis PRiME HLB 作為凈化用 SPE 小柱，3 個(gè)水平標(biāo)準(zhǔn)混合溶液對(duì)應(yīng)的回收率平均值為62.60%～117.20%；采用Polyclean X-HLB 凈化小柱，得到的回收率平均值為51.50%～123.40%。Polyclean X-HLB凈化的平均回收率比Oasis PRiME HLB 凈化的平均回收率低8.3 個(gè)百分點(diǎn)。

表4 13 種性激素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

續(xù)表4

3 小結(jié)

凈化樣品時(shí)，分別對(duì)Waters Oasis PRiME HLB和Polyclean X-HLB 這2 種固相萃取柱進(jìn)行凈化效果的比較，試驗(yàn)結(jié)果表明，Oasis PRiME HLB 與Polyclean X-HLB 柱凈化效果存在差異。Oasis PRiME HLB 凈化的平均回收率比Polyclean X-HLB 凈化的平均回收率高8.3 個(gè)百分點(diǎn)。Oasis PRiME HLB 凈化時(shí)每個(gè)成分在各個(gè)加標(biāo)水平上的回收率相對(duì)平均偏差較小，波動(dòng)性也較小。13 種性激素在雞蛋基質(zhì)中的線性良好，定量限在1.50～41.00 μg/kg，回收率RSD為 0.21%～14.08%，在 雞 蛋 中 50.00、100.00、200.00 μg/kg添加水平上的回收率平均值為62.60%～117.20%。因此PRiME HLB 作為凈化用SPE 小柱，是更好的選擇。抽取13 個(gè)不同批次雞蛋進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明大部分雞蛋中黃體酮項(xiàng)目檢出，其他性激素類(lèi)均未檢出。黃體酮檢出濃度無(wú)規(guī)律性，13批雞蛋中3 批未檢出黃體酮，10 批次黃體酮檢出濃度為5.40～74.00 μg/kg。取檢出黃體酮的同一批次10 個(gè)雞蛋分別制樣并檢測(cè)，結(jié)果顯示黃體酮檢出濃度為5.00～80.00 μg/kg。因此，推斷黃體酮的含量存在個(gè)體差異。