劉 笑 ，李林杰 ，王昱涵 ，王志萍

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，南寧 530200；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，南寧 530023）

火索藤（Bauhinia aureaLevl.），又名牛蹄藤、紅絨毛羊蹄甲、紅毛藤、金葉羊蹄甲、合掌風(fēng)、九龍?zhí)?、黃麻藤，壯藥名“huha”（“愈合”之意），為豆科羊蹄甲屬植物火索藤的根或莖，亦有全株入藥的記載［1，2］。主要產(chǎn)自廣西、貴州、云南等地［3，4］，是廣西壯族自治區(qū)（簡稱廣西）特色壯藥材，在廣西壯族民間有一定的使用歷史。其性溫，味微苦、澀，具有祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛的功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、鶴膝風(fēng)、跌打損傷、腎炎、黃疸型肝炎等癥［4，5］。國內(nèi)外對火索藤的研究報道較少，主要是化學(xué)成分研究［6］，鮮見其質(zhì)量評價方面的報道?；鹚魈僭诿耖g存在同名異物的情況，不同地區(qū)常出現(xiàn)用藥混亂的現(xiàn)象，而該藥又缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使得各地用藥質(zhì)量不一，臨床療效差異較大，因此，建立火索藤的質(zhì)量控制方法十分必要。中藥材指紋圖譜是一種具有高度專屬性的特征圖譜，目前已被廣泛應(yīng)用于質(zhì)量控制等方面。建立中藥材指紋圖譜不僅能較全面地反映藥材所含成分的相互關(guān)系，而且還可以對不同批次藥材進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，有效地鑒別藥材的產(chǎn)地和真?zhèn)危梢暂^好地控制藥材的質(zhì)量，確保藥材質(zhì)量的穩(wěn)定。本研究對火索藤進(jìn)行HPLC 指紋圖譜研究，建立不同產(chǎn)地火索藤甲醇提取物的HPLC 指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價、聚類分析和主成分分析，以期更好地對其質(zhì)量進(jìn)行評價和控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 火索藤樣品分別采自廣西來賓市、岑溪市、梧州市、玉林市、河池市及南寧市等不同市縣或鄉(xiāng)鎮(zhèn)，其中采自廣西來賓市興賓區(qū)天堂鄉(xiāng)的火索藤經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)專家韋松基教授和廣西中醫(yī)藥研究所黃云峰副研究員鑒定為豆科植物火索藤的帶葉藤莖，編號HST-1，作為對照藥材，并將其莖、葉、果莢制成臘葉標(biāo)本。2～10 批按采收日期分別編號HST-2～HST-10。樣品信息見表1。

表1 火索藤樣品信息

1.1.2 試劑 色譜級乙腈、色譜級甲醇、分析純甲醇、磷酸。

1.1.3 試藥 表兒茶素（純度99.82%，批號RP190620）對照品購自成都麥德生科技有限公司；金絲桃苷（純度 98.49%，批號 MUST-20052210）、槲皮苷（純度98.87%，批號MUST-20121401）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 SQP 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；FLBP-200 型萬能高速粉碎機，上海菲力博食品機械有限公司；PL-FS40T 型超聲波清洗機，東莞康士潔超聲波科技有限公司；島津LC-2030C 3D 型高效液相色譜儀（包括PAD 型檢測器、LabSolution 工作站），日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 火索藤HPLC 指紋圖譜方法的構(gòu)建

1）供試品溶液的制備。取火索藤對照藥材粉末（過2 號篩）1 g，精密稱定，置于帶塞錐形瓶中，精密量取25 mL 甲醇加入，稱重，超聲處理1 h，放涼后甲醇補足失重，搖勻，過濾。取濾液過0.45 μm 微孔濾膜。

2）混合對照品溶液的制備。精密稱取表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.048、0.052、0.112 mg/mL 的混合對照品溶液。

3）色譜條件。色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水；梯度洗脫：0～40 min，8%～16%乙腈；40～60 min，16%～18% 乙腈；60～65 min，18%～20% 乙腈；65～85 min，20%～28%乙腈；85～100 min，28%～40%乙腈；流速 1.0 mL/min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長212 nm。

1.2.2 方法學(xué)考察

1）精密度試驗。按照“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定并記錄。

2）重復(fù)性試驗。 取火索藤藥材（批號20190726）6 份，按照“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定。

3）穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 火索藤HPLC 指紋圖譜的建立

按照“1.2.1”方法，得到火索藤甲醇提取液HPLC 指紋圖譜。將混合對照品色譜圖與火索藤的指紋圖譜進(jìn)行對比，比較二者的保留時間，可指認(rèn)火索藤指紋圖譜中的3、9、11 號峰分別為表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷（圖1）。

圖1 混合對照品（A）及火索藤供試品（B）的HPLC

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗 以11 號峰（槲皮苷）為參照，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD值為0.029%～0.131%，相對峰面積的RSD值為0.176%～0.811%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗 以11 號峰（槲皮苷）為參照，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD值為0.128%～0.587%，相對峰面積的RSD值為1.653%～2.986%，表明建立的方法重復(fù)性好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 以11 號峰（槲皮苷）為參照，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD值為0.095%～0.348%，相對峰面積的RSD值為0.167%～2.963%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 10 批火索藤HPLC 指紋圖譜的建立

2.3.1 共有峰的確定 取10 批火索藤樣品，按“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，將10 批火索藤樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”中進(jìn)行色譜峰處理，采用中位數(shù)法，以0.1 min 為時間寬度，S1（HST-1）為參照圖譜，選擇分離度好、含量較大的11個色譜峰作為壯藥火索藤的指紋圖譜共有特征峰，經(jīng)色譜圖多點校正后自動匹配并生成對照指紋圖譜R，得到10 批火索藤的指紋圖譜（圖2）。

圖2 10 批火索藤HPLC 指紋圖譜

2.3.2 相似度評價 在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”中，選擇“計算相似度”，系統(tǒng)則以生成的對照指紋圖譜R 為對照，對10 批火索藤藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度計算，HST-1～HST-10，相似度分別為0.974、0.939、0.958、0.907、0.986、0.986、0.932、0.938、0.969、0.969。10 批火索藤指紋圖譜的相似度均在0.900 以上，表明廣西不同產(chǎn)地火索藤的化學(xué)組成一致性較好。

以11 號峰（槲皮苷）為參照峰，分別計算10 批火索藤指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。10 批火索藤11 個共有峰的相對保留時間的RSD值為0.054%～0.349%，說明11 個共有峰的出峰時間較穩(wěn)定，反映了不同產(chǎn)地不同批次火索藤的化學(xué)成分一致性好；相對峰面積的RSD值為36.885%～101.756%，表明不同產(chǎn)地不同批次火索藤的共有成分含量差異較大，猜測與土壤、氣候的差異等因素有關(guān)。

2.4 聚類分析

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件，以11 個共有峰的峰面積數(shù)據(jù)為變量，以Ward 法作為聚類方法，以平方Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對10 批火索藤指紋圖譜共有峰的峰面積進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 10 批火索藤聚類分析

由圖3 可知，歐氏距離為5.5 時，10 批火索藤樣品可分為 4 類，第 1 類：HST-1、HST-5、HST-6；第 2類：HST-2、HST-3、HST-4、HST-9；第 3 類：HST-8；第4 類：HST-7、HST-10。聚為一類的樣品可反映其在共有峰表達(dá)上的相似性。

2.5 主成分分析

運用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件，以11 個共有峰的峰面積數(shù)據(jù)為變量（Z 標(biāo)準(zhǔn)化后）進(jìn)行主成分分析。主成分提取分析結(jié)果見表2。

表2 主成分解釋的總方差

按照特征值大于1 的標(biāo)準(zhǔn)，抽取出2 個主成分，分別記作 PC1、PC2。PC1 的特征值為 7.770，PC2 的特征值為1.852，分別能解釋70.634%、16.836%的總體變異度，2 個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)87.470%，即涵蓋了火索藤指紋圖譜中87.470%的化學(xué)信息，表明這2 個主成分能夠代表最初的11 個共有峰來分析與藥材質(zhì)量的相關(guān)性。

成分矩陣可以反映各原始因素與不同成分的相關(guān)程度。相關(guān)系數(shù)絕對值越大，說明該原始變量與這個提取因子關(guān)系更密切。共有峰主成分矩陣見表3。

表3 共有峰主成分矩陣

由表 3 可知，峰 2～峰 10 在 PC1 上有明顯載荷，歸屬為PC1，因此PC1 主要反映了2～10 號色譜峰的信息，其中3 號峰為表兒茶素、9 號峰為金絲桃苷；而峰 1、峰11 在 PC2 上負(fù)荷較多，將其歸屬為 PC2，PC2集中反映1 號、11 號色譜峰的信息。由于PC1 的特征值與方差貢獻(xiàn)最大，因此其變量的權(quán)重值在很大程度上可反映化學(xué)成分與藥材質(zhì)量的相關(guān)性。比較PC1 中各變量的權(quán)重值，大于0.8 的變量對應(yīng)的峰為2～9 號峰，說明這8 個峰對藥材質(zhì)量影響較大。

主成分公因子表達(dá)式可由主成分系數(shù)矩陣計算而得，主成分系數(shù)矩陣見表4。主成分公因子表達(dá)式如下。

表4 主成分得分系數(shù)矩陣

PC1=-0.057×Z 峰 1+0.123×Z 峰 2+0.114×Z 峰 3+0.125×Z 峰 4+0.107×Z 峰 5+0.126×Z 峰 6+0.116×Z 峰7+0.120×Z 峰 8+0.127×Z 峰 9+0.095×Z 峰 10+0.035×Z峰11

PC2=0.451×Z 峰 1+0.102×Z 峰 2+0.164×Z 峰 3+0.080×Z 峰 4-0.169×Z 峰 5-0.015×Z 峰 6-0.153×Z 峰7+0.153×Z 峰 8-0.006×Z 峰 9-0.116×Z 峰 10+0.451×Z峰11

經(jīng)計算可得到各批次主成分得分，再以2 個主成分所對應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率占所提取主成分累計方差貢獻(xiàn)率的比例為權(quán)重系數(shù)建立模型，計算各批次的綜合得分（表 5），模型為 Y=70.634×PC1/87.470+16.836×PC2/87.470。

表5 各批次主成分得分及綜合得分

由表5 可知，同一產(chǎn)地的PC1 與PC2 分值排名不一定相同，說明評價不同產(chǎn)地藥材的質(zhì)量應(yīng)當(dāng)結(jié)合各項指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，因此結(jié)合2 個主成分因子的綜合評分，按分值高低排序得到10 批火索藤藥材的綜合排名為 HST-7＞HST-10＞HST-8＞HST-1＞HST-6＞HST-3＞HST-5＞HST-9＞HST-2 ＞ HST-4，將同個產(chǎn)地的分值平均后，可得到7 個不同產(chǎn)地火索藤質(zhì)量的綜合排名為南寧隆安＞來賓興賓＞岑溪安平＞梧州龍圩＞河池東蘭＞玉林北流＞玉林容縣，其中采自南寧隆安的火索藤藥材整體質(zhì)量最好。

對各批次共有峰面積進(jìn)行主成分分析后，根據(jù)各批次的PC1、PC2 得分，建立以PC1 得分為橫坐標(biāo)、PC2 得分為縱坐標(biāo)的空間散點坐標(biāo)系，得到10 批次火索藤的主成分空間得分（圖4）。

圖4 不同批次火索藤的主成分空間得分

由圖 4 可知，2 個主成分可將 10 批藥材分成 4 個類別，HST-1、HST-5、HST-6 為一類，HST-2、HST-3、HST-4、HST9 為一類，HST-8 聚為一類，HST-7、HST-10 聚為一類，與聚類分析結(jié)果一致。

3 小結(jié)與討論

為了較全面控制火索藤的內(nèi)在質(zhì)量，應(yīng)選擇與藥材藥效相關(guān)的成分作為指標(biāo)成分。通過查找相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，表兒茶素具抗氧化、降脂降糖、預(yù)防心血管疾病、抗炎、保護神經(jīng)、抑菌等作用［7］，金絲桃苷具抗肝損傷、抗炎、抗菌、抗癌、抗血栓、抗氧化應(yīng)激作用（抗炎、解痙、利尿、局部和中樞鎮(zhèn)痛等）［8-10］，槲皮苷具抗炎鎮(zhèn)痛作用，抗炎活性主要表現(xiàn)為對致炎性因子的抑制［11］，3 種成分均與火索藤的藥效作用相關(guān)，故將其作為指紋圖譜的指標(biāo)性成分。本研究指認(rèn)了指紋圖譜中的3 種已知成分，表兒茶素（3 號峰）、金絲桃苷（9 號峰）和槲皮苷（11 號峰）。其中槲皮苷的含量較高，峰面積占總峰面積的比例適宜，故將槲皮苷色譜峰（11 號峰）作為參照峰（S）。

本研究建立了火索藤甲醇提取物的HPLC 指紋圖譜，確定了11 個共有峰，指認(rèn)了其中3 種成分；各批次火索藤的指紋圖譜相似度均大于0.90，說明所建立的指紋圖譜具有良好的穩(wěn)定性和可控性；通過對不同批次火索藤進(jìn)行聚類分析、主成分分析，找到對藥材質(zhì)量影響較大的8 個成分，并對不同批次、不同產(chǎn)地的火索藤進(jìn)行了綜合評價，可為其質(zhì)量評價與控制提供依據(jù)。