徐 靜，王 超，伍 勇，吳秀麗，馬澤剛

（四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院，四川 自貢 643000）

137Cs 作為生物學(xué)上最危險(xiǎn)的放射性核素之一，在自然界的本底值很低，隨著核工業(yè)的發(fā)展、核設(shè)施的運(yùn)行以及突發(fā)性核事故，尤其是切爾諾貝利核事故和日本福島核事故，導(dǎo)致Cs 在自然界的本底值不斷升高［1］。美國(guó)核能研究所（NEI）研究發(fā)現(xiàn)，每年有2 000～2 300 t 的核廢物通過(guò)各種途徑釋放到環(huán)境，大量放射性核素Cs 累積在水體和土壤，極易通過(guò)農(nóng)作物和果蔬進(jìn)入食物鏈，不但對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重污染，還會(huì)對(duì)動(dòng)物和人類健康造成極大的潛在威脅［2，3］。因此 Cs 污染的生物效應(yīng)及其修復(fù)技術(shù)的研究一直是近年來(lái)的關(guān)注熱點(diǎn)。以往Cs 污染對(duì)植物影響的研究主要集中在植物生長(zhǎng)、種子萌發(fā)、生物量、抗氧化酶活性以及不同植物對(duì)Cs 的富集能力等方面［4-6］，但Cs 對(duì)植物光合作用的影響鮮有報(bào)道。光合作用是生物界最基本的物質(zhì)和能量代謝過(guò)程之一，且對(duì)逆境脅迫非常敏感。筆者及實(shí)驗(yàn)室前期圍繞Cs 脅迫對(duì)植物光合作用的影響進(jìn)行了系列研究，結(jié)果表明外源高濃度CsCl 處理會(huì)抑制植物葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間 CO2濃度（Ci）以及蒸騰速率（Tr），與此同時(shí)，葉綠素的合成、光合電子傳遞活性也會(huì)受到一定抑制，從而對(duì)植物光合作用造成顯著影響［7］。

快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線是指暗適應(yīng)的植物部分組織突然暴露在可見(jiàn)光下，其熒光隨時(shí)間變化的曲線。JIP-測(cè)定（JIP-test）是以生物膜能量流動(dòng)為基礎(chǔ)，針對(duì)快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線建立的數(shù)據(jù)分析和處理方法，利用該方法可以獲得有關(guān)光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ complex，PSII）的大量信息，從而了解環(huán)境因子影響下植物材料光合機(jī)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化情況［8］。另外，已有研究表明，植物對(duì)穩(wěn)定性銫和放射性銫同位素的吸收及其在體內(nèi)的積累有相同的特征［9］。因此，試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，以菠菜（Spinacia oleraceaL.）為試驗(yàn)材料，用穩(wěn)定性銫同位素133Cs 代替放射性同位素137Cs，利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析，進(jìn)一步探究不同濃度Cs 處理對(duì)植物光合作用的影響機(jī)制，以期為揭示Cs 對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響以及Cs 污染的植物修復(fù)技術(shù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)以藜科植物菠菜作為供試材料，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康菠菜幼苗，移栽至8 kg/盆石英砂中（盆高25 cm，直徑33 cm），每盆6 株。分別設(shè)置0、1、5、10、20 mmol/L 5 個(gè)CsCl 處理濃度。待菠菜幼苗長(zhǎng)到5 葉期時(shí)，用含不同濃度 CsCl 的 Hoagland（pH 6.0）營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行處理，每天補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液100 mL，處理15 d后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)處理5 次重復(fù)。

1.2 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

參考 Strasser 等［10］的方法，葉片在測(cè)定前，先充分暗適應(yīng)20 min，然后暴露在飽和脈沖光下，用MPEA（Hansatech，英國(guó)）測(cè)量菠菜葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（O-J-I-P 曲線）。

1.3 JIP-test分析

獲得的O-J-I-P 曲線用JIP-test 進(jìn)行分析，需要用到 20 μs 時(shí)熒光（O 相，F(xiàn)o）、300 μs 時(shí)熒光（K 相）、2 ms時(shí)熒光（J相）、30 ms時(shí)熒光（I相）和最大熒光（P相，F(xiàn)M）。JIP-test分析所用的參數(shù)及其定義見(jiàn)表1。

表1 JIP-test分析所用的參數(shù)及其定義

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCl 處理對(duì)菠菜快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的影響

將不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度Ft標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化后的熒光強(qiáng)度用Vt表示，以Vt繪制O-J-I-P 標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1-A-1、1-B-1、1-C-1）。受 CsCl 不同處理濃度及不同處理時(shí)間的影響，菠菜葉片均呈現(xiàn)典型的葉綠素快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線，形狀相似且到達(dá)P 點(diǎn)的時(shí)間差異不明顯。為了較為清晰地比較不同環(huán)境差異對(duì)菠菜葉片熒光信號(hào)強(qiáng)度的差異，以0 處理為對(duì)照，用其他與對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化熒光差值（ΔVt）重新作圖（圖1-A-2、1-B-2、1-C-2）。結(jié)果表明，CsCl 處理后，菠菜葉片的J 點(diǎn)發(fā)生變化，1～5 mmol/L CsCl 處理菠菜幼苗 6、9 d 后，J 點(diǎn)降低，但當(dāng)處理濃度達(dá)到 10～20 mmol/L 時(shí)，J 點(diǎn)顯著升高，同樣，CsCl 處理 12 d 后，J點(diǎn)均高于對(duì)照。

圖1 不同濃度CsCl處理菠菜葉片快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線

2.2 CsCl 處理對(duì)菠菜PSII 電子供/受體側(cè)性能的影響

圖2 顯示不同濃度CsCl 處理菠菜后，菠菜葉片J相相對(duì)可變熒光（Vj）、I 相相對(duì)可變熒光（Vi）、可變熒光Fk占FJ-Fo振幅的比例（Wk）、熒光誘導(dǎo)曲線的初始斜率（Mo）、標(biāo)準(zhǔn)化后的J-P 相和直線F=FM之間的面積（Sm）和從 2 ms 到tFm時(shí)間段內(nèi) QA氧化還原次數(shù)（N）的變化情況，從而推測(cè)CsCl 處理對(duì)菠菜葉片PSII 電子供/受體側(cè)性能的影響。隨CsCl 處理濃度和處理時(shí)間的增加，Vj和Wk值呈先上升后下降的趨勢(shì)，Vi明顯下降。其中，Vj在處理濃度為1 mmol/L，處理6 d 時(shí)達(dá)最高值；Wk在處理濃度為10 mmol/L、處理時(shí)間12 d 時(shí)達(dá)最高值，較同期對(duì)照增加了33.94%。Mo值隨CsCl 處理濃度和處理時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先略微下降后上升趨勢(shì)，當(dāng)CsCl 處理濃度為0～5 mmol/L時(shí)，Mo值變化不顯著，但當(dāng)處理時(shí)間較長(zhǎng)，CsCl 處理抑制了從QA-往下的電子傳遞，此時(shí)QA被還原得最快，Mo值逐漸升高，并在20 mmol/L 達(dá)到最高。Sm在處理 6、9 d 后變化不顯著，但處理 12 d 后，Sm值均高于對(duì)照，且與同期對(duì)照相比，Sm分別升高了7.1%、24%、9.2%、17.8%。N值變化均不顯著。

圖2 不同濃度 CsCl處理對(duì)菠菜葉片 Vj、Vi、Wk、Mo、Sm和 N 的影響

2.3 CsCl處理對(duì)菠菜反應(yīng)中心的影響

圖3 表示不同濃度CsCl 處理菠菜葉片后，單位反應(yīng)中心光合機(jī)構(gòu)比活性參數(shù)單位反應(yīng)中心吸收的能量（ABS/RC）、單位反應(yīng)中心熱耗散掉的能量（DIo/RC）、單位反應(yīng)中心捕獲的能量（TRo/RC）、單位反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量（ETo/RC）的相對(duì)變化值。當(dāng)CsCl 處理濃度較低時(shí)（1～5 mmol/L），ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC值略有升高，隨 CsCl 處理時(shí)間的延長(zhǎng)以及處理濃度的增加，尤其是在較高濃度（10～20 mmol/L）處理下，PSII 反應(yīng)中心不斷降解和失活，且在20 mmol/L處理12 d時(shí)達(dá)最大值，ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC分別較對(duì)照組增加了39.73%、22.01%、26.64%、24.19%。

圖3 不同濃度CsCl處理對(duì)菠菜幼苗ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC 的影響

2.4 CsCl 處理對(duì)菠菜PSII 量子產(chǎn)量及光合性能參數(shù)的影響

如圖 4 所示，CsCl 脅迫后，菠菜葉片 PSII 最大量子效率（φPo）呈先略微上升后下降趨勢(shì)，且在1 mmol/L處理時(shí)達(dá)最高值，分別較對(duì)照組增加了1.67%（6 d）、1.56%（9 d）、1.07%（12 d），在 20 mmoml/L 處理時(shí)達(dá)最低值，分別較對(duì)照降低了3.63%（6 d）、3.62%（9 d）、3.77%（12 d）。φEo代表吸收的光量子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA-下游的其他電子受體的概率、Ψo代表捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA-下游的其他電子受體的概率也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)，低濃度脅迫并未引起菠菜葉片φEo、Ψo的顯著變化，但在10～20 mmol/L 處理濃度下φEo、Ψo顯著降低。以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIABS）隨CsCl處理濃度及處理時(shí)間的升高，其值顯著下降，并在20 mmol/L 處理12 d時(shí)達(dá)最低值，較同期對(duì)照降低了33.11%。

圖4 不同濃度CsCl處理對(duì)菠菜幼苗φPo、φEo、Ψo和PIABS的影響

3 小結(jié)與討論

當(dāng)植物遭受外界環(huán)境脅迫時(shí)，不能像動(dòng)物一樣移動(dòng)到更適宜的環(huán)境中去，因此，植物為了生存，必須能夠迅速識(shí)別外界刺激，并產(chǎn)生和傳遞信號(hào)，通過(guò)激發(fā)自身的防御機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫［11］。光合作用是植物將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過(guò)程，是植物對(duì)逆境最為敏感的生理過(guò)程之一。在光合機(jī)構(gòu)捕獲光能發(fā)生電子傳遞的同時(shí)，還有一部分能量以熱和熒光的形式耗散，如果電子傳遞過(guò)程受到阻礙，熒光和熱耗散便會(huì)上升。快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)可以利用植物在逆境脅迫下發(fā)出的豐富的熒光信號(hào)，來(lái)間接監(jiān)控植物葉片PSII 受損程度、受損部位及光合電子傳遞情況，為深入研究逆境脅迫對(duì)光合作用原初反應(yīng)的影響提供了有力而便捷的工具［10］。

典型的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線有OJ-I-P 等相，曲線特征位點(diǎn)的變化較為直觀地表明PSII反應(yīng)中心原初光化學(xué)反應(yīng)的變化，其中J相反映QA-瞬間最大積累量，研究表明，J 相上升代表PSII 受體側(cè)QA到QB間的電子傳遞受阻［12］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度 CsCl 處理菠菜葉片 6、9、12 d 后，J 相發(fā)生變化。1～5 mmol/L CsCl 處理菠菜葉片 6、9 d 后，J相略微降低，推測(cè)此時(shí)PSII 受體側(cè)沒(méi)有受到過(guò)多傷害，機(jī)體可以通過(guò)調(diào)節(jié)QA到QB間的電子傳遞能力來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化，但當(dāng)CsCl 處理濃度增加或處理時(shí)間延長(zhǎng)后，J 相顯著上升，說(shuō)明此時(shí)CsCl 處理可能抑制了QA到QB間的電子傳遞過(guò)程，PSII受體側(cè)受到損傷。

在光合機(jī)構(gòu)中，天線色素吸收的光能被轉(zhuǎn)化為激發(fā)能，再傳遞到兩個(gè)光系統(tǒng)的反應(yīng)中心，進(jìn)而推動(dòng)原初光化學(xué)反應(yīng)，被激發(fā)的電子被移交給原初電子受體QA，生成QA-。2 ms 時(shí)熒光（J 相）、30 ms 時(shí)熒光（I 相）分別顯示了2 ms 和30 ms 時(shí)QA-的第一次瞬時(shí)最大積累，因此Vj和Vi可以反映葉片中QA和QA-的比例。研究表明，外界脅迫會(huì)在一定程度上導(dǎo)致QA/QA-的氧化還原勢(shì)上調(diào)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同CsCl處理濃度下，Vj隨濃度的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，Vi呈明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明較高CsCl處理濃度下會(huì)導(dǎo)致QA/QA-的氧化還原勢(shì)上調(diào)。Wk代表可變熒光Fk占Fj-Fo振幅的比例，Wk數(shù)值的大小會(huì)受到PSII 供體側(cè)和受體側(cè)傷害程度的共同影響［13］。Strasser等［14］認(rèn)為K 點(diǎn)是由于 PSII 供體側(cè)放氧復(fù)合體（OEC）流向PSII反應(yīng)中心的電子與PSII反應(yīng)中心流向受體側(cè)的電子的不平衡造成的。若單純是OEC 受傷，次級(jí)電子供體酪氨酸殘基的電子仍能流向PSII反應(yīng)中心，進(jìn)而流向受體側(cè)，此時(shí)Wk值升高，但當(dāng)PSII 供體側(cè)和受體側(cè)同時(shí)受到傷害，會(huì)使得PSII 供體側(cè)流向PSII 反應(yīng)中心的電子減少，與此同時(shí)，PSII 反應(yīng)中心流向受體側(cè)的電子也減少，因此，Wk值的大小可以反映OEC 相對(duì)于受體側(cè)的限制程度，Wk值越大，表明供體側(cè)限制越大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)CsCl 脅迫，隨處理濃度和處理時(shí)間的增加，菠菜葉片的Wk呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，但總體高于對(duì)照。推測(cè)較短時(shí)間內(nèi)較低濃度CsCl 處理會(huì)導(dǎo)致菠菜PSII 供體側(cè)OEC 受到一定損傷，且傷害程度大于受體側(cè)，但隨處理濃度和處理時(shí)間的增加，PSII 受體側(cè)受到損傷，這與快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線中J 相在較高濃度處理下顯著上升的結(jié)論一致。Mo代表QA被還原的相對(duì)速率，菠菜葉片經(jīng)CsCl 脅迫后，Mo同樣呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)處理時(shí)間較長(zhǎng)，CsCl 處理抑制了從QA-往下的電子傳遞，此時(shí)QA被還原得最快，Mo值最高。Sm代表標(biāo)準(zhǔn)化后的J-P 相和直線F=FM之間的面積，它反映了從2 ms 到tFm時(shí)間內(nèi)QA下游的電子受體庫(kù)的大小，也就是關(guān)閉所有反應(yīng)中心需要的能量。N代表從2 ms 到tFm時(shí)間內(nèi)QA的氧化還原次數(shù)。從QA-傳遞走的電子比例越高，Sm的值就越大。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，隨CsCl 處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Sm值逐漸升高，此時(shí)，菠菜葉片從QA-傳遞走的電子較多，PSII受體側(cè)的電子傳遞能力增強(qiáng)。

當(dāng)機(jī)體受到外界脅迫時(shí)，部分反應(yīng)中心失活，失活的反應(yīng)中心天線捕獲的光能被傳遞到有活性的反應(yīng)中心上，因此有活性的反應(yīng)中心比活性會(huì)升高。本研究中，當(dāng) CsCl 處理濃度較低時(shí)（1～5 mmol/L），ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC參數(shù)值略有升高，隨CsCl 處理時(shí)間的延長(zhǎng)以及處理濃度的增加，PSII 反應(yīng)中心不斷降解和失活，剩余的有活性的反應(yīng)中心的比活性參數(shù)大幅度升高，說(shuō)明外界脅迫導(dǎo)致菠菜葉片PSII 反應(yīng)中心遭到不同程度損傷，反應(yīng)中心部分失活，從而增加剩余反應(yīng)中心的激發(fā)壓。

φPo、φEo、Ψo隨著 CsCl 處理濃度的增加，呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，低濃度脅迫下，菠菜通過(guò)調(diào)節(jié)受體側(cè)QA傳遞電子的能力，即有活性的反應(yīng)中心的開(kāi)放程度升高，促使PSII光合活性增大，從而適應(yīng)外界環(huán)境的變化，但當(dāng)處理濃度增加，φPo、φEo、Ψo下降，說(shuō)明此時(shí)光和機(jī)構(gòu)被逐漸破壞。PIABS是JIP-test 的參數(shù)中對(duì)環(huán)境變化最為敏感的參數(shù)之一，它可以反映植物利用光能的綜合性能，常作為了解整個(gè)原初光化學(xué)反應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的響應(yīng)依據(jù)［15］。本研究中，PIABS顯著下降，也說(shuō)明 CsCl 脅迫導(dǎo)致菠菜葉片原初光化學(xué)反應(yīng)受到一定傷害，從而影響光合作用。

綜上所述，利用快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)分析，可以直觀表現(xiàn)CsCl 脅迫對(duì)菠菜光合作用原初反應(yīng)的影響。CsCl脅迫下，菠菜葉片的OJIP 曲線、PSII供/受體側(cè)性能參數(shù)、反應(yīng)中心、PSII 量子產(chǎn)量等均受到一定影響，且高濃度處理影響較為明顯。1～5 mmol/L 較低CsCl 濃度處理雖然抑制了菠菜PSII 反應(yīng)中心供體側(cè)到反應(yīng)中心的電子傳遞過(guò)程，但影響不顯著，可能是菠菜通過(guò)調(diào)節(jié)光合機(jī)構(gòu)對(duì)光能的捕獲和轉(zhuǎn)化效率來(lái)緩解傷害，從而來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化，這也是植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫的一種自我保護(hù)機(jī)制，但高濃度CsCl 處理則會(huì)導(dǎo)致菠菜葉片PSII 受體側(cè)同樣受到傷害、QA/QA-的氧化還原勢(shì)上調(diào)以及反應(yīng)中心部分失活。