陳 偉，谷新晰，張莉娟，談蘇慧，田洪濤，盧海強*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

單寧酶（EC 3.1.1.20）能夠催化單寧底物酯鍵和縮酚酸鍵的水解，從而釋放沒食子酸、鞣花酸及對應(yīng)醇[1-2]。單寧酶應(yīng)用到食品領(lǐng)域可以解決由單寧引起的品質(zhì)問題，使產(chǎn)品品質(zhì)得到改善。如Lu等[3]發(fā)現(xiàn)單寧酶處理可以大大減少綠茶茶湯“茶乳”的形成，并且使茶湯具有更好的顏色外觀和口感；Zhang Yingna等[4]通過單寧酶水解綠茶生產(chǎn)具有極佳回甘的茶飲料；單寧酶應(yīng)用到葡萄汁、腰果梨汁、橙汁、刺梨汁和石榴汁等果汁當(dāng)中，水解果汁中的單寧，起到澄清、脫苦和脫澀的作用[5-8]；Selwal等[9]將單寧酶應(yīng)用到葡萄酒中，起到澄清的作用。

面對復(fù)雜的應(yīng)用環(huán)境和大量的應(yīng)用需求，挖掘具有良好酶學(xué)性質(zhì)的新單寧酶向來是研究熱點。目前，進行的異源表達和酶學(xué)性質(zhì)表征的單寧酶主要來源于微生物。Dai Xinlong等[10]從植物中發(fā)現(xiàn)并鑒定了參與植物單寧降解的單寧酶基因，植物單寧酶在植物單寧代謝中起重要作用，重組植物單寧酶對多個天然底物（如表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯和β-五沒食子酰葡萄糖）表現(xiàn)出較高的催化效率，而重組植物單寧酶的相關(guān)性質(zhì)鮮見報道。同時，Dai Xinlong等[10]推測富含單寧的植物基因組中很可能含有單寧酶基因，這一發(fā)現(xiàn)為新單寧酶的挖掘和研究提供了新方向，植物中可能存在具有理想性質(zhì)或適合于各種單寧底物的新單寧酶。

本研究將茶樹單寧酶基因CsTanA（GenBank：MK381269.1）參照大腸桿菌（Escherichia coli）密碼子偏好性進行優(yōu)化，并在大腸桿菌BL21（DE3）中重組表達。重組茶樹單寧酶rCsTanA利用Ni-NTA親和層析進行分離純化及酶學(xué)性質(zhì)表征，旨在探究植物來源單寧酶的酶學(xué)特性和為重組茶樹單寧酶rCsTanA應(yīng)用研究提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài) 天根生化科技（北京）有限公司；硫酸卡那霉素（Kan）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、質(zhì)粒提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；標準分子質(zhì)量Marker 河北瑞帕特生物科技有限公司；羅丹寧、沒食子酸甲酯（methyl gallate，MG）、沒食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）、沒食子酸正丙酯（propyl gallate，PG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、單寧酸（tannic acid，TA） 上海源葉生物科技有限公司；Ni-NTA瓊脂糖 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液器 德國Eppendorf公司；酶標儀美國Bio-Rad公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）設(shè)備 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；立式高速低溫離心機 日本Hitachi公司；JY88-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樹單寧酶基因CsTanA密碼子優(yōu)化及合成

使用RARE CODON CALTOR（https://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html#opennewwindow）對茶樹單寧酶基因（GenBank：MK381269.1）進行稀有密碼子分析。以大腸桿菌為表達宿主，采用JAVA Condon Adaption Tool（https://http://www.jcat.de/）對茶樹單寧酶基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化的序列中避免EcoRI和NotI酶切位點。5’端與3’端分別引入EcoRI和NotI酶切位點，優(yōu)化的序列由金斯瑞生物科技有限公司合成并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-CsTanAopt。

1.3.2 序列信息分析

使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列一致性分析。使用CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進行多序列比對。使用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）進行茶樹單寧酶CsTanA的蛋白質(zhì)同源建模。使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）基于CsTanA同源建模結(jié)果和多序列比對結(jié)果確定進化保守性，結(jié)合Pymol進行可視化分析，氨基酸殘基以梯度著色。使用ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）計算單寧酶的分子質(zhì)量和等電點。

1.3.3 重組菌的構(gòu)建與表達

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，涂布于含Kan的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。隨機挑取3個單菌落接種于10 mL Kan終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，再以1%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接到50 mL Kan終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600nm達到0.6左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)12 h，取發(fā)酵液4 ℃離心收集表達菌體。

1.3.4 重組茶樹單寧酶rCsTanA的純化及SDS-PAGE分析

重組茶樹單寧酶rCsTanA N端帶有6hHis標簽，故通過Ni-NTA親和層析對rCsTanA進行純化分離。取1 g濕質(zhì)量表達菌體加入5 mL pH 7.0磷酸緩沖液（0.2 mol/L）使表達菌體重懸，使用超聲波細胞粉碎機（功率150 W，工作5 s、間歇5 s，處理2 min）處理重懸表達菌體。離心收集破碎上清液與提前平衡好的Ni柱相結(jié)合，用9 mL pH 7.0磷酸緩沖液（0.2 mol/L）分3次加入洗滌雜蛋白，分別用3 mL含20、40、80、100、200 mmol/L和300 mmol/L咪唑的平衡液梯度洗脫目的蛋白，測定單寧酶活性并進行SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。以牛血清白蛋白作為標準蛋白質(zhì)，通過Bradford方法測定單寧酶蛋白質(zhì)濃度。

1.3.5 單寧酶活力的測定

參考Sharma等[11]的方法并稍作調(diào)整，取100 μL適當(dāng)稀釋酶液與400 μL沒食子酸丙酯溶液（1.25 mmol/L，pH 6.0）混勻，于30 ℃條件反應(yīng)，10 min后加入300 μL羅丹寧甲醇溶液（50 mmol/L）終止反應(yīng)，加入200 μL 0.5 mol/L KOH溶液顯色，穩(wěn)定5 min后在520 nm波長處測定吸光度。以每分鐘生成1 μmol沒食子酸所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.3.6 重組茶樹單寧酶rCsTanA的酶學(xué)特性分析

最適溫度和pH值的測定：以pH 6的PG為底物，在0、10、20、30、40、50、60、70 ℃和80 ℃條件下測定純化rCsTanA的最適溫度；在不同pH值（pH 2～3的100 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液、pH 3～8的100 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和pH 8～12的100 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液）和測得的最適溫度條件下測定純化rCsTanA的最適pH值。

熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的測定：rCsTanA在40 ℃和50 ℃保溫0、5、10、20、30 min和60 min，在最適溫度和pH值條件下測定殘余酶活力，以處理0 min的酶活力為100%；將rCsTanA置于不同pH值（2.0～12.0）緩沖液中，0 ℃保溫1 h后，在最適溫度和pH值條件下測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理rCsTanA活力為100%。

1.3.7 金屬離子及化學(xué)試劑對重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

在標準反應(yīng)體系中加入不同金屬離子、表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使其終濃度分別為1 mmol/L和5 mmol/L，測定酶活力；加入表面活性劑吐溫80及甲醇、乙醇和異丙醇等有機試劑，使其體積分數(shù)分別為1%和5%，測定酶活力。以未添加其他化學(xué)試劑所測得的酶活力為100%。

1.3.8 重組茶樹單寧酶rCsTanA的底物特異性及動力學(xué)常數(shù)的測定

以濃度為1.25 mmol/L的MG、EG、PG、EGCG和濃度為0.4 mmol/L的TA測定純化重組單寧酶rCsTanA活力。以MG、EG、PG、TA和EGCG（濃度范圍為0.05～10.00 mmol/L）為底物，在最適條件下反應(yīng)10 min以估算動力學(xué)參數(shù)，即Km和Vmax的值，動力學(xué)參數(shù)的計算基于Lineweaver-Burk圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

所有實驗重復(fù)測定3次，利用Excel 2016和GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用fs表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹單寧酶基因CsTanA的優(yōu)化

編碼茶樹單寧酶的野生型基因全長900 bp，編碼299個氨基酸和1個終止密碼子。經(jīng)分析野生型茶樹單寧酶基因存在37個大腸桿菌稀有密碼子和兩處連續(xù)稀有密碼子（CUA CCC和GGA CCC）。參照大腸桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化密碼子后，稀有密碼子全部被替換，優(yōu)化前后基因序列的一致性為77.8%，GC含量由此前的53.2%減小至51.9%，密碼子適應(yīng)指數(shù)由0.58提高至0.8，更接近于理想值1.0[12]。

2.2 生物信息學(xué)分析

利用SWIS-SMODEL對茶樹單寧酶CsTanA進行同源建模研究，選擇與CsTanA同源性為37.54%的晶體結(jié)構(gòu)（PDB:6rj8）為模板以模擬CsTanA蛋白的結(jié)構(gòu)。選擇了分別源自柿子（QEE79633.1）、葡萄（QEE796030.1）、柑橘（XP_02403513.1）、核桃（QEE79629.1）和草莓（QEE79629.1）的5個植物單寧酶，同茶樹單寧酶CsTanA進行多序列比對。使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）基于模擬的CsTanA蛋白的結(jié)構(gòu)和多序列比對結(jié)果確定進化保守性，結(jié)合Pymol進行可視化分析，結(jié)果如圖1所示。CsTanA屬于α/β水解酶超家族，整體結(jié)構(gòu)由2個結(jié)構(gòu)域組成，球形α/β水解酶折疊域和一個Lid結(jié)構(gòu)域。與微生物來源的單寧酶相比，茶樹單寧酶CsTanA沒有復(fù)雜的帽子結(jié)構(gòu)域，同時α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域也相對簡單，除了必需的5個α螺旋和8個β折疊，沒有過多的α螺旋和β折疊插入α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域[13-14]。茶樹單寧酶CsTanA的α/β水解酶折疊核心域由5個α螺旋圍繞8個β折疊，形成了α/β水解酶折疊域，Lid結(jié)構(gòu)域由2個平行的β折疊和1個反平行的β折疊組成。CsTanA具有不規(guī)則的疏水底物口袋，保守的催化三聯(lián)體殘基為Ser159、Asp241和His273，Asp241和His273位于疏水底物口袋入口表面處排成一排，Ser159位于底物口袋底部；保守基序HGG（75～77）位于底物口袋內(nèi)部，Gly76-Gly77形成一個氧陰離子空穴結(jié)構(gòu)。研究表明該結(jié)構(gòu)與酶活性有關(guān)，相同的結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)在了獼猴桃羧酸酯酶AeCXE1當(dāng)中，活性口袋中的Gly92-Gly93形成氧陰離子空穴并且起到穩(wěn)定中間體的作用[10,15]。如圖1所示，通過計算進化保守性，基于該結(jié)構(gòu)的多序列比對顯示了氨基酸殘基保守和多變的位置，確定了底物口袋結(jié)構(gòu)中的殘基是高度保守的，這些進化上穩(wěn)定的殘基在催化、配體結(jié)合和保持蛋白質(zhì)支架的完整性中起重要作用，結(jié)構(gòu)表面的大多數(shù)氨基酸被標記為高度可變。通過對植物來源單寧酶蛋白序列及結(jié)構(gòu)的分析，為進一步分子改造研究提供理論基礎(chǔ)。

圖1 單寧酶CsTanA三維結(jié)構(gòu)及進化保守性圖Fig.1 Schematic diagram of the tertiary structure and evolutionary conservatism of CsTanA

2.3 重組茶樹單寧酶rCsTanA的純化及SDS-PAGE分析

茶樹單寧酶CsTanA的等電點和理論分子質(zhì)量分別為5.61和33.09 kDa。重組茶樹單寧酶rCsTanA N端帶有6hHis標簽，使其可以通過Ni-NTA親和層析進行分離純化。對不同濃度咪唑的洗脫液（20、40、80、100、200 mmol/L和300 mmol/L）的洗脫結(jié)果進行單寧酶活性的測定，40 mmol/L咪唑的洗脫結(jié)果單寧酶活性最高，而80 mmol/L咪唑的洗脫結(jié)果無單寧酶活性。破碎上清液重組茶樹單寧酶rCsTanA比活力為0.35 U/mg，純化后的rCsTanA比活力為1.53 U/mg，純化倍數(shù)約為4.4。如圖2所示，rCsTanA的分子質(zhì)量約為39 kDa，rCsTanA的N端融合表達了6hHis標簽，使單寧酶蛋白N端多出52個氨基酸殘基（約5.23 kDa），故實際分子質(zhì)量大于理論分子質(zhì)量（33.09 kDa）。

圖2 純化重組酶rCsTanA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant rCsTanA

2.4 重組茶樹單寧酶rCsTanA的酶學(xué)特性分析

2.4.1 溫度對重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

如圖3A所示，rCsTanA在0～70 ℃的溫度范圍內(nèi)均有活性，其最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在30～40 ℃之間可保持64%以上的酶活力，溫度高于40 ℃酶活力急劇下降，50 ℃時酶活力僅為33.9%。如圖3B所示，rCsTanA在30 ℃條件下處理60 min后，仍保持66.0%的酶活力；在40 ℃條件下處理10 min后，酶活力保持在52.2%。

圖3 重組酶rCsTanA的最適溫度（A）、溫度穩(wěn)定性（B）、最適pH值（C）及pH值穩(wěn)定性（D）Fig.3 Optimum temperature (A), temperature stability (B), optimum pH (C) and pH stability (D) of recombinant rCsTanA

2.4.2 pH值對重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

在40 ℃的反應(yīng)溫度下，測定了rCsTanA在pH 2.0～12.0的酶活性，結(jié)果如圖3C所示。rCsTanA的最適pH值為7.0，在pH 6.0～9.0內(nèi)酶活力可維持在60.0%以上。將rCsTanA酶液置于不同pH值條件下，0 ℃保溫1 h后，測定rCsTanA殘余酶活力，由圖3D可知，該酶在pH 6.0～10.0之間具有較好的穩(wěn)定性，殘余酶活力均保持在80%以上。

2.4.3 金屬離子及化學(xué)試劑對重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

金屬離子對重組酶rCsTanA活力的影響結(jié)果見表1。經(jīng)測定Na+、K+、Li+、Mg2+（僅1 mmol/L）、Mn2+和Ca2+均對rCsTanA活力有明顯促進作用，其中K+可使其酶活力提高約37%。而Ag+、Zn2+、Cu2+、Fe3+及Al3+對rCsTanA活力具有不同程度的抑制作用，Ag+、Cu2+和Fe3+抑制作用較強，使rCsTanA活力均小于20%，其中5 mmol/L Cu2+可使rCsTanA失活。黃蕾等[16]報道了Cu2+和Fe3+對重組煙曲霉單寧酶AfTanA具有較強的抑制作用，5 mmol/L Cu2+和Fe3+可使重組酶失活。Kanpiengjai等[17]報道了Cu2+對重組戊糖乳桿菌單寧酶LpTanBA-7和LpTanQA1-5均有較強抑制作用，1 mmol/L Cu2+抑制了2個重組酶約70%的活力，Na+、K+、Ca2+、Mg2+及Al3+則為LpTanBA-7和LpTanQA1-5的激活劑。Ag+、Cu2+和Fe3+等重金屬離子對大多數(shù)單寧酶有抑制作用，因為這些重金離子可能與酶活性部位的巰基、色氨酸殘基或羧基結(jié)合在一起形成復(fù)合物，阻礙酶與底物結(jié)合而生成產(chǎn)物[18-19]。

表1 金屬離子對重組酶rCsTanA的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity of recombinant rCsTanA

如表2所示，所測11種試劑對rCsTanA均有不同程度的抑制作用，且抑制作用隨添加量增大而增大。在螯合劑EDTA存在下，以金屬離子為輔基的酶會表現(xiàn)出酶活性急劇下降。在1 mmol/L和5 mmol/L的EDTA存在下，重組酶rCsTanA活力分別為（94.52f5.68）%和（83.27f8.58）%，并未表現(xiàn)出酶活性急劇下降，這表明該酶不使用金屬離子作為輔因子。表面活性劑SDS、吐溫80和CTAB有較強抑制作用，1 mmol/L的SDS幾乎完全抑制了rCsTanA活力，5 mmol/L的吐溫80使rCsTanA活力喪失80%以上，5 mmol/L CTAB可使rCsTanA失活。甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮（極性溶劑）會抑制酶活性，可能是因為極性化合物會降低酶微環(huán)境中周圍的水含量[20]。

表2 化學(xué)試劑對重組酶rCsTanA的影響Table 2 Effects of chemical reagents on the activity of recombinant rCsTanA

2.4.4 重組茶樹單寧酶rCsTanA的底物特異性及動力學(xué)參數(shù)

在最適反應(yīng)條件下，測定純化重組茶樹單寧酶rCsTanA的底物特異性及動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3所示。純化重組酶rCsTanA對MG、EG、PG和EGCG酶活力分別為0.40、0.71、0.80 U/mL和0.53 U/mL，但對TA并未表現(xiàn)出水解酶活性。進一步進行酶動力學(xué)分析，由底物MG、EG、PG和EGCG測得的Km分別為（2.25f0.12）、（1.30f0.04）、（1.66f0.11）mmol/L和（1.91f 0.06）mmol/L，Vmax分別為（4.10f0.19）、（9.17f0.24）、（10.54f0.09）mmol/（Lgmin）和（3.59f0.15）mmol/（Lgmin）。rCsTanA對天然底物（EGCG）的催化效率略低于合成底物（EG和PG）。rCsTanA對合成底物（MG、EG和PG）酶活性隨著合成底物烷基長度增加而提高。

表3 重組酶rCsTanA的底物特異性及動力學(xué)參數(shù)Table 3 Substrate specificity and kinetic parameters of recombinant rCsTanA

3 討 論

本研究以大腸桿菌BL21（DE3）為表達宿主對茶樹單寧酶CsTanA進行重組表達，SDS-PAGE分析顯示純化的重組酶分子質(zhì)量約為39 kDa，rCsTanA的N端融合表達了6hHis標簽，使單寧酶蛋白N端多了52個氨基酸殘基（約5.23 kDa），故實際分子質(zhì)量大于理論分子質(zhì)量（33.09 kDa）。茶樹單寧酶CsTanA的分子質(zhì)量更接近于細菌來源的單寧酶，細菌單寧酶分子質(zhì)量一般為31～90 kDa[1-2]。本研究將茶樹單寧酶CsTanA成功進行原核表達后，又嘗試將其在巴斯德畢赤酵母GS115中進行真核表達。真核表達的重組茶樹單寧酶未檢測出單寧酶活性，其分子質(zhì)量約為50 kDa（數(shù)據(jù)未在文中給出），可能是巴斯德畢赤酵母對茶樹單寧酶CsTanA過度的糖基化修飾造成了重組酶失活。

重組茶樹單寧酶rCsTanA的最適溫度為40 ℃，在30～40 ℃之間可保持64%以上的酶活力，溫度高于40 ℃酶活力急劇下降。目前研究的單寧酶最適溫度的范圍一般為30～50 ℃，如黑曲霉單寧酶Tan7的最適溫度為40 ℃，當(dāng)溫度高于40 ℃酶活力活性急劇下降[21]；煙曲霉單寧酶AfTanA、戊糖乳桿菌單寧酶LpTanQA1-5和路鄧葡萄球菌單寧酶的最適溫度為40 ℃，但在30～50 ℃的溫度范圍內(nèi)可保持60%以上的酶活力[16-17,22]。重組茶樹單寧酶rCsTanA具有較高的反應(yīng)溫度，但較微生物來源的單寧酶相比，對溫度的適應(yīng)范圍和穩(wěn)定性稍顯遜色。

重組茶樹單寧酶rCsTanA的最適pH值為7.0，在pH 6.0～9.0反應(yīng)條件下酶活力保持在60.0%以上，在pH 6.0～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，處理1 h后殘余酶活力均在80%以上。多數(shù)細菌來源的單寧酶在中性或弱堿性環(huán)境中有較高酶活力，最適pH值多在7.0～8.0的范圍內(nèi)[2]。在最適pH值這一酶學(xué)性質(zhì)上，rCsTanA與細菌來源的單寧酶相似，在堿性條件下更為穩(wěn)定。路鄧葡萄球菌單寧酶同rCsTanA一樣在酸性環(huán)境中酶活力較低，但經(jīng)固定化后的路鄧葡萄球菌單寧酶在pH 5.0時酶活力為65%，酶活力提高了35%[22]。這為提高rCsTanA在酸性環(huán)境中的酶活力提供了方法。

Na+、K+、Li+、Mg2+（僅1 mmol/L）、Mn2+和Ca2+均可使重組茶樹單寧酶rCsTanA活力提高20%以上，其中K+可使酶活力提高約37%。Ag+、Cu2+和Fe3+對重組茶樹單寧酶rCsTanA抑制作用較強，使rCsTanA活力均小于20%，其中5 mmol/L Cu2+可使rCsTanA失活。研究表明多數(shù)重金屬（如Hg2+、Ba2+、Pb2+、Cd2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Ag+）對單寧酶有較強的抑制作用，這些離子可能與酶活性部位的巰基、色氨酸殘基和或羧基結(jié)合在一起形成復(fù)合物，阻礙酶與底物結(jié)合而生成產(chǎn)物[16-19,23-27]。表面活性劑SDS、吐溫80和CTAB對重組茶樹單寧酶rCsTanA有較強抑制作用，可使rCsTanA失活。表面活性劑與單寧酶蛋白的直接作用和減少疏水作用，使得單寧酶的性質(zhì)產(chǎn)生變化，SDS、Triton X-100、吐溫20和吐溫80對黑曲霉單寧酶rAntan1、源自陰溝腸桿菌的單寧酶和肺炎克雷伯菌的單寧酶同樣有較強抑制作用[18,23-24,28]。而SDS對源自枯草芽孢桿菌PAB2的單寧酶和路鄧葡萄球菌的單寧酶的酶活力具有促進作用[22,29]；EDTA、Triton X-100和吐溫80可使單寧酶TanBFnp的酶活力分別提高106%、142%和69%[30]。甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮（極性溶劑）會抑制重組茶樹單寧酶rCsTanA活力，可能是因為極性化合物會降低酶微環(huán)境中周圍的水含量[17]。但也有少數(shù)單寧酶對有機溶劑表現(xiàn)出較強耐受能力，如源自枯草芽孢桿菌PAB2的單寧酶和戊糖乳桿菌的單寧酶可乙醇、甲醇、異丙醇、甘油和異戊醇等有機溶劑激活[17,29]。

重組茶樹單寧酶rCsTanA對天然底物TA未表現(xiàn)出水解活性，但微生物來源的單寧酶一般均對TA具有較高的水解活性。rCsTanA對天然底物EGCG的催化效率略低于合成底物EG和PG。相比于大分子底物，小分子底物似乎更易于與重組茶樹單寧酶rCsTanA的活性位點結(jié)合。TA分子質(zhì)量為1 701.2 Da，是EGCG分子質(zhì)量的3.7 倍，過多的沒食子酸酰基占據(jù)了較大的空間位置，阻礙了TA與重組茶樹單寧酶rCsTanA的活性位點結(jié)合，使TA無法被rCsTanA水解，但具體分子機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

對茶樹單寧酶基因進行密碼子優(yōu)化并在大腸桿菌進行融合表達，經(jīng)分析重組茶樹單寧酶rCsTanA蛋白分子質(zhì)量為39 kDa，比活力為1.53 U/mg，rCsTanA最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH值為7.0，在堿性條件下更為穩(wěn)定。Na+、K+、Li+、Mg2+、Mn2+和Ca2+均對rCsTanA活力有明顯促進作用，而Ag+、Cu2+和Fe3+對該酶有明顯抑制作用；EDTA、SDS、吐溫80、CTAB、尿素、甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮均對rCsTanA活力有抑制作用，其中SDS和CTAB的抑制作用最強。綜上所述，重組茶樹單寧酶rCsTanA在食品工業(yè)中具有較好的應(yīng)用潛力。