王明釋，蔣代華，黃雪嬌，李圣會，張 宇，黃金蘭，鄧華為，鐵文周

一株高效還原亞硒酸鹽的粘質(zhì)沙雷氏菌的分離鑒定及特性①

王明釋，蔣代華*，黃雪嬌，李圣會，張 宇，黃金蘭，鄧華為，鐵文周

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004)

從廣西欽州市欽北區(qū)的富硒土壤中篩選出一株可高效還原亞硒酸鹽的細(xì)菌QZB-1。16S rDNA 基因序列分析確定菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌()。研究發(fā)現(xiàn)菌株QZB-1 可耐高達180 mmol/L 的亞硒酸鹽。進一步研究發(fā)現(xiàn)菌株QZB-1 在36 h 之內(nèi)對1 mmol/L 亞硒酸鹽的還原率為95%，隨著硒濃度升高還原率有所下降。正交實驗表明，對菌株還原亞硒酸鹽的影響程度依次是初始亞硒酸鹽濃度>培養(yǎng)時間>接種量，最佳還原條件是初始亞硒酸鹽濃度為1 mmol/L，接種量為10%，培養(yǎng)時間為36 h，此時菌株QZB-1 對亞硒酸鹽的還原率大于98.55%。研究結(jié)果表明新型亞硒酸鹽還原菌粘質(zhì)沙雷氏菌QZB-1 可高效還原亞硒酸鹽為單質(zhì)納米硒，可高效應(yīng)用于亞硒酸鹽污染水體和土壤的治理。

粘質(zhì)沙雷氏菌；亞硒酸鹽還原；分離；鑒定；特性

硒(Se)是人體必需的微量元素之一，通過硒蛋白在體內(nèi)發(fā)揮重要作用[1]。在全球大氣、海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)中，硒的循環(huán)通常以4種價態(tài)存在：Se(-II)、Se(0)、Se(IV) 和Se(VI)，其中Se(IV) 流動性大，毒性最強[2]。人體對硒的攝入閾值較窄[3]，如果攝入過量的硒將會導(dǎo)致人的認(rèn)知能力下降[4]、膽固醇升高[5]、Ⅱ形糖尿病及前列腺癌、肌肉硬化等疾病的發(fā)生[6]。硒污染主要包括礦石、沉積巖、化石燃料和火山山脈土壤中的自然來源，以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、采礦、燃煤、殺蟲劑生產(chǎn)、金屬提取、煉油、玻璃制造和光電管等的人為污染[7-9]。目前環(huán)境中硒污染控制技術(shù)包括：膜分離技術(shù)、共沉淀技術(shù)、吸附處理技術(shù)、化學(xué)還原法、生物還原法等，前4個技術(shù)存在著運營和維護成本高、產(chǎn)物處理難、反應(yīng)條件苛刻、二次污染風(fēng)險等問題，反之生物還原法是一種較為環(huán)保、高效的方法[10]。

微生物通過還原、甲基化和同化硒，影響硒在環(huán)境中的運輸和積累[11]。研究發(fā)現(xiàn)，從富硒環(huán)境中分離篩選的微生物具有較高的亞硒酸鹽還原成納米硒的能力，這些微生物可應(yīng)用于硒污染環(huán)境的修復(fù)工作[12-15]。生物提取硒納米顆粒因其具有比亞硒酸鈉更高的抗氧化活性，可作為抗菌藥物來開發(fā)[16-17]。近年來，Wang 等[18]發(fā)現(xiàn)硒納米顆粒修飾的側(cè)流試劑盒能方便、快速、靈敏地檢測人體血清和血液中的抗體，適用于COVID-19 的流行病學(xué)調(diào)查。此外，Hu 等[19]研究結(jié)果表明硒納米顆粒能被小麥幼苗吸收，其吸收過程與能量無關(guān)，被吸收后的硒納米顆粒迅速氧化為Se(IV) 并轉(zhuǎn)化為有機形式。同時程丹等[20]研究也發(fā)現(xiàn)納米硒可作為有效硒源被杭白菊所吸收利用。當(dāng)前已分離篩選出了諸多的亞硒酸鹽還原微生物，但是大部分微生物存在著硒耐性不高或還原效率低等問題，同時兼有亞硒酸鹽耐性和高還原率的微生物相對較少[21-23]。因此，本試驗以分離自富硒區(qū)的土壤微生物為研究對象，通過加硒培養(yǎng)篩選出具有較高硒耐性的菌株，并測定其對亞硒酸鹽的還原率和還原條件優(yōu)化，以充分發(fā)掘利用還原亞硒酸鹽的微生物資源，也可為今后生物合成納米硒顆粒的制備、硒污染環(huán)境的治理及生物富集硒提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣本采集

土壤采自廣西壯族自治區(qū)欽州市大垌鎮(zhèn)大片村(108°32′53″ E，22°05′31″ N)的天然富硒土壤。大垌鎮(zhèn)位于北回歸線以南，屬海洋性的亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為22 ℃，熱量資源豐富，年均降雨量為2 104.2 mm。山地居多，主要土壤類型以強酸性鐵鋁土為主。采用5 點取樣法，剔除土壤表層的枯枝落葉，采樣深度為0 ～ 20 cm，每個點采集約200 g 土壤，將5 個點的土壤混合均勻，挑去植物殘根及入侵體，最后將土壤放進冷藏箱運回實驗室作進一步分析。土壤的基本理化性質(zhì)為pH 5.47，有機質(zhì)20.80 g/kg，全氮0.99 g/kg，總硒0.81 mg/kg，有效硒71.56 μg/kg。

1.2 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.3 ± 0.03；LB 固體培養(yǎng)基：在LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂15 g/L。

1.3 菌株的分離、純化

參照魏志敏等[24]的方法，取10 g 新鮮土樣加入預(yù)先裝有少量玻璃珠的90 ml無菌PBS(phosphate buffer saline)中，30 ℃、180 r/min 振蕩30 min，靜置5 min，收集土壤懸液，懸液于5 000 r/min 離心15 min，去掉上清液，沉淀用10 ml PBS 懸浮。取2 ml 懸液添加到100 ml 含亞硒酸鹽濃度為1 mmol/L 的LB 液體培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)。30 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)兩天，5% 接種量繼代培養(yǎng)5 次后，用梯度稀釋法制備10–2～ 10–6系列稀釋液，分別取100 μl 涂布到LB 固體培養(yǎng)基中，30 ℃ 下培養(yǎng)至菌落長好，挑取單個菌落，采用平板劃線法獲得菌株純培養(yǎng)物。

1.4 細(xì)菌耐硒能力及生長的測定

挑取分離純化后的單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取100 μl 培養(yǎng)了24 ～ 48 h 的培養(yǎng)液接種于含有不同亞硒酸鹽濃度的LB 固體培養(yǎng)基中。含硒固體培養(yǎng)基中硒的濃度遞增梯度為1、2、5、10、20、30、40、50、60 和70 mmol/L，經(jīng)過加硒培養(yǎng)基淘汰后，篩選出能存活的菌株再進行更高的耐硒濃度試驗。將分離篩選出的耐硒菌株分別接種到含有0、5、25、75 和160 mmol/L 亞硒酸鹽的LB 液體培養(yǎng)基中，測定其生長曲線。菌株在30 ℃ 下以180 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。每隔3 h取樣一次，以根據(jù)活細(xì)胞數(shù)(菌落形成單位，cfu)測定細(xì)菌生長量。通過將樣品稀釋10–6后取100 μl 的相應(yīng)稀釋樣品涂布到LB 固體培養(yǎng)基上，并在30 ℃ 下培養(yǎng)72 h來測定cfu 數(shù)。

1.5 菌株鑒定

菌株形態(tài)觀察及生理生化特征測定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]和《微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》[26]。菌株16S rRNA 基因片段采用16S rRNA 基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′)進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系(50 μl)：引物27F 和引物1492R(20 μmol/L)各1.0 μl；模板DNA 1.0 μl；混合酶包括dNTPs(2.5 mmol/L) 10.0 μl，10 × Buffer 15.0 μl，Taq 酶(5.0 U/μl) 1 μl，H2O 21 μl。PCR 反應(yīng)程序如下：96 ℃ 3 min；93 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR 反應(yīng)結(jié)束后，1% 的瓊脂糖鑒定并使用Axygen 凝膠回收試劑盒回收所需PCR 產(chǎn)物片段。菌株的PCR 擴增產(chǎn)物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成測序，將所得到測序目的序列添加到NCBI 進行Blast 比對，挑選與菌株同源性最為接近的種屬，使用MEGA7.0 進行序列分析，以NJ 法構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株對亞硒酸鹽的還原測定

菌株對亞硒酸鹽還原率的測定是在廖青等[27]的方法下進行優(yōu)化。挑取LB 固體培養(yǎng)基上的單菌落接種于50 ml LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 搖床過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按5% 的比例取活細(xì)菌懸液(600 nm 波長下的吸光度值為0.5)分別接種于初始濃度為1、5、25、75、160 mmol/L 的亞硒酸鹽LB 液體培養(yǎng)基中，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。35 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)36 h。每隔12 h 取樣一次，培養(yǎng)液在10 000 r/min 離心10 min 后，用HG-AFS 法測定上清液中Se(IV) 的濃度。

亞硒酸鹽還原率(%)=(初始總硒–上清液硒含量)/ 初始總硒× 100

1.7 菌株還原亞硒酸鹽的正交試驗

為了確定不同條件對細(xì)菌還原亞硒酸鹽的影響，選取初始亞硒酸鹽濃度、培養(yǎng)時間、接種量3 個因素3 個水平，利用L9(33) 正交試驗表進行正交試驗分析(表1)。試驗共設(shè)計9 個不同的處理，菌株在每個處理培養(yǎng)之后，取培養(yǎng)液10 000 r/min 離心10 min，利用HG-AFS 法測定上清液中Se(IV) 的濃度后計算每個處理的亞硒酸鹽還原率。

表1 正交試驗因素及水平

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2019 進行處理，利用SPSS 26.0 對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Origin 2021 和MEGA 7.0 對數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐硒細(xì)菌的分離篩選

將土壤懸液稀釋后添加到含有亞硒酸鹽的固體培養(yǎng)基上，細(xì)菌菌落變?yōu)榧t色，用滅菌的接種環(huán)挑取不同形態(tài)的菌落分離提純，分離出16 株可以還原亞硒酸鹽的細(xì)菌。將它們作進一步耐硒分析，最終篩選出1 株具有較高硒耐性的細(xì)菌QZB-1，此細(xì)菌在亞硒酸鹽濃度為180 mmol/L 的LB 固體培養(yǎng)基上仍能生長。觀察LB 固體培養(yǎng)基上生長的QZB-1 菌株(圖1A)，細(xì)菌菌落為乳白色，中間隆起，邊緣整齊，表面光滑不透明，菌落直徑介于0.2 ～ 0.3 mm，革蘭氏染色后呈陰性。在含亞硒酸鹽濃度為1 mmol/L 的固體培養(yǎng)基上，如圖1B 所示，QZB-1 菌株因?qū)單猁}還原成紅色單質(zhì)硒，表現(xiàn)為外圈由乳白色包圍的紅色菌落。

(圖A 表示菌株QZB-1 在無硒LB 固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征；圖B 為菌株QZB-1 在含硒LB 固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，紅色菌落表示亞硒酸鹽還原成紅色單質(zhì)硒)

2.2 菌種鑒定

經(jīng)過PCR 產(chǎn)物序列測定，菌株QZB-1 基因PCR 產(chǎn)物序列長度為1 397 bp。將所獲得的菌株16S rDNA 基因序列通過GenBank 中的序列進行基因序列對比，選取與菌株QZB-1 同源性高，已定名的模式菌的序列信息。通過MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育數(shù)，如圖2 所示，菌株QZB-1 序列與PZ11 菌株相似性最高，高達99.93%。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定菌株QZB-1 為粘質(zhì)沙雷氏菌()。

2.3 細(xì)菌在不同亞硒酸鹽濃度脅迫下的生長曲線

為了探究細(xì)菌QZB-1 對亞硒酸鹽(Se2O32–)毒性的反應(yīng)，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的亞硒酸鈉，研究細(xì)菌的生長情況。從圖3 可以看出，不加硒時細(xì)菌QZB-1 沒有明顯的生長停滯期，0 ～ 3 h 為生長對數(shù)期，3 ～ 24 h 細(xì)菌濃度上升變緩，24 ～ 36 h 進入穩(wěn)定期并開始衰亡，細(xì)菌濃度逐漸減少。與不加硒相比，添加亞硒酸鈉的培養(yǎng)基在培養(yǎng)了3 h之后均出現(xiàn)了深淺不同的紅色，表明細(xì)菌具有將有毒的亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為無毒的紅色單質(zhì)硒的能力[28]。由于紅色單質(zhì)硒的干擾，很難用光譜法對培養(yǎng)基的細(xì)菌數(shù)進行定量，所以本試驗采用稀釋平板法來測定培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)量。

細(xì)菌QZB-1 在添加了不同濃度的亞硒酸鹽之后仍然保持良好的生長趨勢，表明劇毒的亞硒酸鹽對細(xì)菌QZB-1 生長的影響不顯著。在細(xì)菌的初始生長階段(0 ～ 3 h)，各處理之間的生長情況差異不明顯，但是在經(jīng)過3 h的培養(yǎng)之后，不同硒濃度處理下的細(xì)菌生長曲線開始顯現(xiàn)出差別。在5 mmol/L 濃度下，細(xì)菌的生物量比不加硒提升明顯，在21 h 處，細(xì)菌生物量比對照的生物量多了2.63×108cfu/ml；在25 mmol/L 亞硒酸鹽濃度下，其生物量在培養(yǎng)了9 h之后也比對照有不同程度的增加，上述研究表明低亞硒酸鹽濃度不僅不會對細(xì)菌QZB-1 產(chǎn)生毒害，反而促進了細(xì)菌的生長。Li 等[29]的研究也證明適量的硒濃度有利于細(xì)胞的存活和生長，然而在Zhang 等[30]研究的不同硒濃度對微生物的生長影響中，硒的存在抑制了細(xì)菌的生長，這可能是本研究篩選的菌株具有更高硒耐性的原因。反之，在亞硒酸鹽濃度為75 mmol/L 和160 mmol/L 之下，培養(yǎng)基中的生物量有了不同程度的減少，其中160 mmol/L 濃度下生物量比不加硒減少了27.2% 左右。試驗結(jié)果表明在75 mmol/L 之后，隨著培養(yǎng)基亞硒酸鹽濃度的增加，其毒性會相應(yīng)地增大，導(dǎo)致微生物量逐漸減少。本試驗中菌株QZB-1 在160 mmol/L 濃度之下還能保持一定的生長，進一步證明了此菌株對毒性亞硒酸鹽具有較高的耐性。

圖2 基于細(xì)菌的16S rDNA 序列以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 細(xì)菌在不同亞硒酸鹽濃度下的生長曲線

2.4 不同亞硒酸鹽濃度對菌株還原率的影響

由圖4 可知，在亞硒酸鹽濃度小于25 mmol/L 的低硒濃度和相同培養(yǎng)時間下，隨著亞硒酸鹽濃度的增加，顯著降低了菌株對亞硒酸鹽的還原率，表明硒濃度升高對菌株還原亞硒酸鹽具有較強的抑制作用。在亞硒酸鹽濃度大于25 mmol/L 的高硒濃度下，相同的培養(yǎng)時間對菌株還原率的影響不顯著，與1 mmol/L 硒濃度下的還原率相比，75 mmol/L 和160 mmol/L 的還原率顯著降低，但后兩者之間差異不顯著，說明菌株對高硒濃度具有穩(wěn)定的適應(yīng)性。同時，在同一濃度下，硒還原率隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，并可能在某一時間點完全還原硒。目前國內(nèi)外報道的亞硒酸鹽還原菌試驗中，還原率普遍偏低，在亞硒酸鹽濃度同為1 mmol/L 的情況下，沈娥等[31]報道的亞硒酸鹽還原菌在36 h 對亞硒酸鹽的還原率僅為60% 左右；Kora[14]試驗表明還原菌在48 h 內(nèi)對1 mmol/L 的亞硒酸鹽還原率為82.73% 左右，說明本研究分離篩選的亞硒酸鹽還原菌具有比前人試驗更高的還原效率。當(dāng)前文獻報道的亞硒酸鹽還原菌有：地衣芽孢桿菌()[32]、貪銅桿菌()[31]、固氮紅細(xì)菌()[33]、大腸桿菌()[3]等60 多種還原細(xì)菌[23]。其中粘質(zhì)沙雷氏菌()也有少量的報道，但是對亞硒酸鹽的耐性偏低或還原率較低[21-22]，同時擁有較高的硒耐性和還原率的粘質(zhì)沙雷氏菌()鮮有報道。

(圖中小寫字母不同表示同一培養(yǎng)時間下不同亞硒酸鹽濃度處理間差異顯著(P<0.05))

2.5 菌株還原亞硒酸鹽的正交試驗

由表2、表3 可知，3 個因素對菌株還原亞硒酸鹽的效率均有一定的影響，但每個因素影響的顯著性水平不同。根據(jù)極差分析值可知：初始亞硒酸鹽濃度對細(xì)菌還原亞硒酸鹽的影響最大，其次是培養(yǎng)時間和接種量，李丹等[34]的研究也證明了亞硒酸鈉添加量對硒的轉(zhuǎn)化率影響最大。由水平之間的差異性表明本次試驗條件下最優(yōu)組合為初始亞硒酸鹽濃度為1 mmol/L、培養(yǎng)時間36 h、接種量10%，在此條件下可提高細(xì)菌對亞硒酸鹽的還原效率。

表2 菌株QZB-1 亞硒酸鹽還原條件正交試驗結(jié)果

注：1k2k3分別表示1、2、3 水平的平均值；表示同一個因素下1k2k3的極差。

表3 正交試驗的方差分析

注：***、**分別表示方差分析達<0.001和<0.01顯著水平。

3 結(jié)論

從富硒區(qū)土壤分離篩選出一株具有硒耐性的菌株QZB-1，經(jīng)16S rDNA 基因序列分析，將其鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌()。菌株對亞硒酸鹽的耐性高達180 mmol/L，同時QZB-1 具有較高的硒還原效率，在36 h 內(nèi)對1 mmol/L 亞硒酸鹽的還原率為95% 左右。正交試驗結(jié)果表明三因素條件對菌株還原亞硒酸鹽的影響順序是初始亞硒酸鹽濃度>培養(yǎng)時間>接種量。最佳的培養(yǎng)條件是初始亞硒酸鹽濃度為1 mmol/L、接種量為10%、培養(yǎng)時間為36 h，該條件下菌株對亞硒酸鹽的去除率高達98.55%。

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Isolation,Identification and Characterization of Awith High Selenite Reduction Efficiency

WANG Mingshi, JIANG Daihua*, HUANG Xuejiao, LI Shenghui, ZHANG Yu, HUANG Jinlan, DENG Huawei, TIE Wenzhou

(College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China)

A bacterium strain QZB-1 with high selenite reduction efficiency was isolated from Se-rich soil in Qinbei District of Qinzhou City, Guangxi Province. The strain was identified asthrough 16S rDNA gene sequence analysis. The results revealed that the strain could tolerate selenite concentration as high as 180 mmol/L. Further study suggested that the strain QZB-1 could reduce 95% of 1 mmol/L selenite within 36 hours, and selenite reduction rate decreased with the increase of selenite concentration. The orthogonal experiment indicated that the rank of influence degree by selenite reduction was initial selenite concentration > incubation time > inoculum. The optimal conditions for selenite reduced were as following: initial selenite concentration 1 mmol/L, inoculation volume 10%, and incubation time 36 hours. Under these conditions, selenite reduction rate was more than 98.55%. The findings suggested that the novel selenite reducing strainQZB-1can efficiently reduce selenite to elemental selenium nanoparticles, and can be effectively applied in the bioremediation of selenite polluted soil and water.

; Selenite reduction; Isolation; Identification; Characterization

S154.39

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.02.014

王明釋, 蔣代華, 黃雪嬌, 等. 一株高效還原亞硒酸鹽的粘質(zhì)沙雷氏菌的分離鑒定及特性. 土壤, 2022, 54(2): 314–319.

廣西科技重大專項(桂科 AA17204037-3)和國家自然科學(xué)基金項目(41661076)資助。

(dhjiang2008@gxu.edu.cn)

王明釋(1993—)，男，廣西憑祥人，碩士研究生，主要從事土壤生態(tài)學(xué)研究。E-mail: 379534014@qq.com