成亮 吳顯峰 周恩成 邢銘

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，多數(shù)病人術后因腫瘤復發(fā)轉移而死亡[1]。胃癌病死率在癌癥中高居第3位[2]。早期胃癌5年生存率達到95%，中晚期5年生存率不足20%[3]。胃癌缺乏早期確診指標，病人發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，手術的病人也會出現(xiàn)復發(fā)和轉移，尋找與胃癌早期相關的生物學標志物就至關重要。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)是一種可同時作用于多肽和磷酸肌醇底物的具有脂質磷酸酶活性的抑癌基因，在信號轉導中具有重要作用[4]。PTEN的主要功能是其脂質磷酸化活性，改變下游PI3K/AKT信號通路，調節(jié)細胞增殖、代謝及細胞結構的形成[5]，PTEN還與細胞周期調節(jié)、遷移及腫瘤進展密切相關[6]。有研究表明，PTEN在細胞核內具有非磷酸酶活性和獨立于PI3K/AKT信號通路的功能[7]，PTEN水平的輕微改變都可能影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究探討PTEN磷酸化(p-PTEN)在胃癌組織中的表達與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預后的關系。

對象與方法

一、對象

2015年1月～2016年1月于我院行胃癌根治術并經病理證實的胃癌病人85例；收集其胃癌組織標本和距癌灶邊緣5cm以上且病理證實為在正常胃黏膜的癌旁組織。85例病人中，男性48例，女性37例；年齡35～73歲，平均年齡(61.23±5.14)歲。收集病人的性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑、浸潤深度、癌坯抗原(CEA)、糖鏈抗原(CA)19-9、脈管癌栓、神經侵犯、TNM 分期、淋巴結轉移等。所有病人胃癌標本均經本院病理證實，病人術前均未行放療、化療及生物治療，入組胃癌病人術后聯(lián)合化學藥物治療，其中以奧沙利鉑+替吉奧(SOX)等化療藥物為主。在組織樣本收集之前均獲得病人知情同意并簽署了知情同意書，排除因各種原因造成的失訪病人。

二、方法

1.p-PTEN水平檢測：采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(streptavidin-perosidase，SP) 法檢測。所有標本取材后經固定、脫水、石蠟包埋，對石蠟塊予以4 μm連續(xù)切片，隨后3%的雙氧水孵育10分鐘后，高溫高壓修復切片10分鐘，滴加一抗二抗，DAB顯色。用已知陽性的胃癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。p-PTEN抗體購自英國Abcam公司(ab47332)。免疫組化SP試劑盒、二抗及DAB 顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2.免疫組化染色結果判定:由兩名經驗豐富的病理科醫(yī)師對免疫組化結果進行評估。由病理科醫(yī)師鏡下隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù)陽性細胞，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，根據染色細胞比例和染色強度進行計分。(1)染色陽性率<5%計0分，5.1%～25%計1分，25.1%～50%計2分，50.1%～75%計3分，>75%計4分。(2)染色強度：未著色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕褐色計3分。根據兩種評分相加將p-PTEN分為兩組，0～1分為低表達組，2分以上為高表達組[8]。

3.隨訪:對所有病人通過電話或查閱病例的方式進行隨訪，隨訪截止時間至2020年1月。隨訪時間為為4～59個月。記錄下病人的總生存期(overall survival，OS)。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據進行分析，計數(shù)資料用例(%)表示，用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法；兩者生存期的比較采用Log-rank 法；預后危險因素采用Cox 比例風險模型進行單因素和多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.胃癌組織和癌旁組織中p-PTEN的表達見表1。結果表明，p-PTEN主要存在于胞核或胞漿內，胃癌組織中的p-PTEN表達水平高于癌旁組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 胃癌組織和癌旁組織中p-PTEN表達的比較(例)

2.胃癌病人p-PTEN的表達與臨床病理特征的相關分析:胃癌組織中p-PTEN的表達與病人的年齡、性別及腫瘤直徑無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；胃癌組織中p-PTEN的表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移有關，p-PTEN的高表達有較高的分化程度、浸潤深度及TNM分期，同時p-PTEN的高表達也有較高的轉移率(P<0.05)。見表2。

表2 胃癌病人p-PTEN的表達與其臨床病理特征的相關分析

3.p-PTEN的表達與胃癌病人預后的關系：85例胃癌病人隨訪時間為4～59個月，中位OS為36.269個月;至隨訪結束，共有49例病人存活，36例死亡。 p-PTEN高表達病人的OS 范圍為3～39個月，中位OS為24.576個月；Kaplan-Meier分析結果表明，p-PTEN高表達病人的OS較p-PTEN低表達病人明顯縮短(P<0.05) 。見圖1。

圖1 p-PTEN的表達與胃癌病人預后的關系

4.影響胃癌病人OS的危險因素分析:將年齡、性別、CEA、CA19-9、脈管癌栓、神經侵犯等臨床相關因素及p-PTEN納入單因素Cox比例風險回歸模型分析，結果顯示，CEA、CA19-9、分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移及p-PTEN表達水平是影響胃癌病人OS的影響因素，見表3；將上述影響因素納入多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，CEA、CA19-9、TNM分期、淋巴結轉移及p-PTEN表達水平是影響胃癌病人OS的獨立風險因素(P<0.05)。見表4。

表3 影響胃癌病人OS的單因素分析

表4 影響胃癌病人OS的多因素分析

討論

WHO在2020年全球癌癥報告中指出，胃癌的年均標化死亡率(ASIR)較高，發(fā)病例數(shù)達到100萬，死亡例數(shù)達到78.3萬[9]。在我國，胃癌在男性惡性腫瘤的發(fā)病率位于第2位，女性位于第4位，總病死率居第2位[10]。早期胃癌癥狀不典型，診斷率低，確診時多處于中晚期。篩選出與胃癌早期相關的生物學標志物就顯得至關重要。

正常情況下，PTEN通過PI3K/AKT信號通路、MAPK途徑和FAK/p130 cas途徑參與調控胰島素信號轉導、誘導細胞凋亡抑制細胞不斷增殖、抑制腫瘤血管形成以及細胞的侵襲和遷移[11-12]。在多種人類腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PTEN的缺失或失活，PTEN的磷酸化是PTEN失活的一種新機制，PTEN的磷酸化可以有多種激酶誘導，如CK2、LKB1、GSK-3β等[13-14]，PTEN的失活會影響細胞信號轉導及非磷酸酶依賴的生物學功能。

我們運用免疫組化法檢測p-PTEN在胃癌組織和癌旁組織中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的p-PTEN表達水平高于癌旁組織，與Papakonstanti 等[15]研究結果一致，說明胃癌病人的PTEN發(fā)生了失活。胃癌組織中p-PTEN的表達與病人的年齡、性別及腫瘤直徑無關；胃癌組織中p-PTEN的表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移有關，同時p-PTEN的高表達也有較高的轉移率，董愛芬等[16]研究認為，PTEN的表達與癌癥的淋巴結轉移具有相關性。以上結果可推測p-PTEN可能會提高腫瘤細胞的侵襲性，刺進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病人中p-PTEN 高表達病人的總生存期較p-PTEN低表達病人縮短。單因素Cox比例風險回歸模型和多因素Cox比例風險回歸顯示，p-PTEN表達水平是影響胃癌病人OS的獨立風險因素。提示p-PTEN的高表達在胃癌病人中可能預示著不良結局，可作為胃癌早期診斷的分子生物學指標。