金一 王昕儀 杜潤森 鄭麗華 趙亞恒 楊艷

乳腺癌的預(yù)后不盡人意。許多分子已被確定為重要的預(yù)后因素。為乳腺癌病人尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，腫瘤組織中的 hsa-mir-337顯著下調(diào)。 Cox分析表明 hsa-mir-337可以作為乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立生物標(biāo)志物。

材料和方法

一、材料

所有數(shù)據(jù)集均使用 R(版本 3.6.0)中的RTCGA Toolbox包下載，包括乳腺癌病人miRNA測序數(shù)據(jù)及其對應(yīng)的臨床病理資料，組織樣本來源于癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫。

二、方法

1.基因集富集分析(GSEA)：使用Broad研究所的GSEA軟件3.0進(jìn)行GSEA分析?；蚪M被認(rèn)為在NOM p-val<0.25時(shí)顯著富集。

2.靶標(biāo)預(yù)測 ：通過三種在線分析工具預(yù)測miRNA的靶基因，分別是TargetScan(http://wwwtargetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://www.mirdb.org/cgi-bin/searc)和miRTarBase。為了進(jìn)一步提高生物信息學(xué)分析的可靠性，我們使用維恩圖將重疊的靶基因和差異表達(dá)的miRNA相交，以識別與miRNA共表達(dá)的基因。熒光素酶檢測用于靶基因的驗(yàn)證。Cox檢驗(yàn)用于鑒定最重要的靶基因。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R-studio 3.6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Boxplots用于離散變量測量表達(dá)差異，χ2檢驗(yàn)用以檢查hsa-mir-337表達(dá)與臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。使用Youden指數(shù)評估的最佳截止值將病人分為hsa-mir-337高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析，使用Log-rank檢驗(yàn)比較曲線。單變量Cox分析用于選擇相關(guān)變量，輸出風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)、P值等。將Cox單因素回歸分析得到的相關(guān)變量進(jìn)一步進(jìn)行多變量Cox分析，用于確定hsa-mir-337的表達(dá)對乳腺癌病人的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。

結(jié)果

1.TCGA數(shù)據(jù)庫資料下載與整理：所有乳腺癌病人數(shù)據(jù)均從TGGA數(shù)據(jù)庫下載，病人總數(shù)為503例。乳腺癌病人數(shù)據(jù)特征見表1。

表1 乳腺癌病人數(shù)據(jù)特征(n=503)

2.hsa-mir-337被認(rèn)為是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素：如圖1A所示，與正常組織相比，hsa-mir-337在腫瘤組織中顯著下調(diào)。Paired-Samples T Test用于驗(yàn)證hsa-mir-337的差異性表達(dá)(圖1B)。Kaplan-Meier 生存分析表明，與高表達(dá)組比較，hsa-mir-337低表達(dá)組的總生存率更差(圖1C)。單變量Cox分析和多變量Cox 分析表明，hsa-mir-337 可以作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。見表2，表3。

A hsa-mir-337在腫瘤組織中的表達(dá)顯著降低。B Paired-Samples T Test用于驗(yàn)證hsa-mir-337的差異表達(dá)。C Kaplan-Meier生存分析表明，與高表達(dá)組相比，低表達(dá)組的總生存期更差。

表2 乳腺癌病人相關(guān)因素的單因素分析

表3 乳腺癌病人相關(guān)因素的多因素分析

3.GSEA 表示與hsa-mir-337相關(guān)的生物學(xué)功能和蛋白質(zhì)：我們進(jìn)行了GSEA(圖 2A、B)來鑒定乳腺癌中激活的生物學(xué)功能 ，發(fā)現(xiàn)部分GO通路在hsa-mir-337低表達(dá)表型中差異性富集，例如GO_BASEMENT_MEMBRANE，GO_COLLAGEN_CONTAINING_EXTRACELLULAR_MATRIX(表4)。隨著hsa-mir-337表達(dá)的降低，ECM PECEPTOR INTERACTION、FOCAL ADHESION等信號通路也出現(xiàn)了差異性富集(表4)。

圖2 通過GSEA進(jìn)行功能注釋

表4 hsa-mir-337低表達(dá)相關(guān)GO通路與KEGG通路

4.目標(biāo)預(yù)測：通過靶基因預(yù)測，并利用維恩圖將重疊的靶基因和差異表達(dá)的miRNA相交，我們確定了53個(gè)hsa-mir-337的潛在靶基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)，隨著hsa-mir-337的上調(diào)，C2CD2、CXCR2、FREM1、GAS7、GHR、NKAPL、PCDH18、SYT4的表達(dá)水平上調(diào)，而ESRP1的表達(dá)水平下調(diào)。另外，Kaplan-Meier生存分析表明，這些mRNA的差異表達(dá)顯示出更差的總生存期。

討論

miRNA是是一類長度約為21～ 25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈 RNA，它可以通過抑制信使RNA(mRNA)翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。它可以參與和調(diào)控多種生理和病理過程，包括細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、遷移、侵襲、自噬和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究表明，miRNAs在各種惡性腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)，在腫瘤生物標(biāo)志物中顯示出巨大的潛力。例如，MiR-126 通過與多種分子相互作用在乳腺癌中發(fā)揮重要作用[1]。miR-378的上調(diào)通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[2]。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們實(shí)現(xiàn)抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

有研究表明，hsa-mir-337在非小細(xì)胞肺癌的癌變過程中起著至關(guān)重要的作用，可以作為非小細(xì)胞肺癌有前景的生物標(biāo)志物[3]。miR-337在胃癌的發(fā)生過程中也起到了一定作用[4-5]。miR-337通過直接靶向KRAS抑制AKT和ERK通路，在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中作為腫瘤抑制因子[6]。此外，miR-337通過靶向STAT3/Wnt/β-catenin軸調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和侵襲，影響胰腺癌的發(fā)生[7]。據(jù)報(bào)道，miR-200家族水平升高與包括乳腺癌在內(nèi)的種癌癥的不良預(yù)后有關(guān)[8]。同樣，hsa-miR- 21-5p被認(rèn)為是主要的致癌miRNA之一，在多種癌癥(例如，乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌[9-11]和非小細(xì)胞肺癌)中觀察到其上調(diào)。研究表明，miR-4417的低表達(dá)與三陰性乳腺癌病人較差的預(yù)后顯著相關(guān)[12]。

mIR196A的表達(dá)也被證明是晚期和絕經(jīng)后ER+病人的可靠預(yù)后因素[13]。有研究進(jìn)行了整合microRNA和mRNA免疫細(xì)胞特征的構(gòu)建，以預(yù)測乳腺癌和卵巢癌病人的生存[14]。

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中hsa-mir-337的表達(dá)顯著下調(diào)。我們進(jìn)行了單變量Cox分析和多變量Cox分析，以確定hsa-mir-337表達(dá)對病人總生存期的影響,結(jié)果表明,hsa-mir-337可以作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。為了進(jìn)一步探索hsa-mir-337的生物學(xué)作用，我們進(jìn)行了GSEA分析，發(fā)現(xiàn)GO_BASEMENT_MEMBRANE、GO_CONDENSED_CHROMOSOME等差異表達(dá)。隨著hsa-mir-337的減少，各種信號通路也受到影響，如ECM PECEPTOR INTERACTION、FOCAL ADHESION。

此外，我們證實(shí)了隨著hsa-mir-337的上調(diào)，C2CD2、CXCR2、FREM1、GAS7、GHR、NKAPL、PCDH18、SYT4上調(diào)，而ESRP1而下調(diào)，可以作為hsa-mir-337的靶基因[15]。然而，hsa-mir-337與這些基因之間相互作用的具體機(jī)制尚不清楚。如果進(jìn)一步闡明它們之間的作用機(jī)制，hsa-mir-337的應(yīng)用將會更廣泛。