張金花，何靜，張小彥，李彥湘，張恒，張樹衡，丁德東，李柄霖

(甘肅農業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070)

枸杞根腐病是一種危害性很大的維管束系統(tǒng)病害，在枸杞整個生育期都可發(fā)病，一般于6月中旬發(fā)病，7～8月為發(fā)病盛期[1]。主要危害根莖部和根部，發(fā)病初期病部呈褐色至黑褐色，逐漸腐爛，后期外皮脫落，只剩下木質部，剖開病莖可見維管束褐變[2]，發(fā)病初期不易發(fā)現(xiàn)，一經發(fā)現(xiàn)，則被害根部腐爛已經很嚴重，難以治愈，是一種毀滅性病害[3]。腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)是該病的主要致病菌之一[4]。該菌在土壤中以菌絲體形式長期存活，從植株的根部入侵，沿維管束擴展蔓延，最終導致植株死亡[3]。近幾年來，隨著枸杞栽培面積快速增加，枸杞根腐病害也隨之增加，給杞農造成了很大損失[5]?，F(xiàn)階段化學防治是控制該病害的主要手段，生產上一般采用石硫合劑、代森錳鋅、50%托布津可濕性粉劑、40%滅病威等進行灌根處理[6]。然而，化學藥劑的大量使用會帶來諸多負面影響，如生產成本高、污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡以及對人畜健康也存在潛在威脅[7]。因此尋找安全、無污染的綠色防控措施已成為當務之急。近年來活性物質誘導植物產生抗病性的研究成為植物病害防控的新興領域[8]，目前己發(fā)現(xiàn)多種活性物質具有明顯的誘導抗性作用，如苦參堿[9]、丁香酚[10]、桂枝主要活性物質[11]和姜黃素類似物等[12]。

誘導植物抗病性，別稱系統(tǒng)獲得抗性(SAR)，即利用生物或非生物因子預先處理植物，使原來的感病反應產生局部的或系統(tǒng)的抗病性[13]，已經成為植物病害防治中很有發(fā)展前景的技術途徑之一，對生產無公害植物產品更具有重要的意義[14]，是生物防治的延伸，是目前植物病害防治研究領域的熱點之一。馬鈴薯糖苷生物堿(potato glycoalkaloids，TGA)是馬鈴薯產生的一類次級代謝產物，屬于甾體類物質，主要成分為α-茄堿和α-查茄堿[15]，約占總糖苷生物堿含量的95%[16]。研究表明，馬鈴薯糖苷生物堿是一種植物源活性物質，具有廣泛的生物活性[17]，具有對環(huán)境污染小易降解，且資源豐富可再生等優(yōu)點[18]，因此有很好的藥用價值和開發(fā)潛力[19]，除此之外，具有一定的毒性，可以幫助植物抵抗和防御外界有害物的侵染或生長[20]，從而增強植物的抗病性。目前，馬鈴薯糖苷生物堿在食品、醫(yī)藥、飼料等領域中的功能已經得到廣泛認可[21]，關于馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞根腐病的誘導抗性方面的研究還鮮有報道。

本研究以馬鈴薯糖苷生物堿為材料，通過其對枸杞根腐病的誘導抗性作用發(fā)揮的最佳濃度、最佳間隔期與持續(xù)時間以及對枸杞PPO、POD、SOD、PAL抗性相關酶酶活性的研究，以探明其對枸杞根腐病的誘抗效應，以期為枸杞根腐病生物防治新途徑提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 供試材料 供試枸杞為寧杞1號2年生盆栽苗，供試藥劑為馬鈴薯糖苷生物堿。

1.1.3 供試菌種 供試菌種為枸杞根腐病病原菌—腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)，由甘肅農業(yè)大學林學院森林保護實驗室提供，試驗前在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，potato dextrose agar)平板上純化備用。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯糖苷生物堿的提取 馬鈴薯糖苷生物堿的提取采用乙酸-氨水沉淀法[22]，即得質量濃度為5.000 0 g/mL。根據(jù)顯色原理可在530 nm處測定消光值，從標準曲線上查出樣品液TGA濃度，計算出TGA含量為0.502 5 mg/g。

1.2.2 誘導效應研究 (1)誘導效果最佳濃度的篩選：選用生長狀況大致相同的健壯枸杞苗株，分別用0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 g/mL TGA 2 mL根莖注射[23](皮層多點注射)處理5 d后挑戰(zhàn)接種(以甲醇+接種、清水+接種為對照)，采用傷根灌根法[24]每盆接種1.0×106個/mL菌懸液500 mL(取生長7 d的腐皮鐮刀菌)，每個處理5盆，3次重復。接種后插上編號標簽，每隔2 d澆灌清水保持土壤濕潤，各處理于接種后第20天調查葉和根的發(fā)病情況，以枸杞葉和根的病情指數(shù)計算誘導抗性效果。(2)誘導抗性最佳間隔期與持續(xù)時間的測定：基于上述試驗，2.500 g/mL TGA 2mL誘導枸杞后第1、5、10、15、20、25、30、35天分別挑戰(zhàn)接種，以確定抗性最佳間隔期及持續(xù)期，并在最佳間隔期重復誘導，按上述方法和材料挑戰(zhàn)接種，統(tǒng)計及誘導效應計算同上。

1.2.3 病情指數(shù)分級標準 枸杞葉片發(fā)病程度分級參考方中達《植病研究法》[25]，枸杞根部發(fā)病程度分級參考李姝江方法[26]，分級標準如下：Ⅰ級：葉片萎蔫數(shù)<植株葉片總數(shù)10%，無脫落，代表值0；Ⅱ級：葉片萎蔫數(shù)占葉片總數(shù)11%～30%，無脫落，代表值1；Ⅲ級：葉片萎蔫數(shù)占葉片總數(shù)31%～50%，有少量脫落，代表值2；Ⅵ級：葉片萎蔫數(shù)占葉片總數(shù)51%～70%，有少量脫落，代表值3；Ⅴ級：葉片萎蔫數(shù)占葉片總數(shù)70%以上，部分脫落，代表值4。Ⅰ級：根部健康，代表值0；Ⅱ級：根莖部表皮褐變，剖開莖部褐變面積少于5%，根須腐爛在15%以下，代表值1；Ⅲ級：根莖部表皮褐變腐爛或剖開莖部褐變面積在5%～30%，根須腐爛在30%以下，代表值2；Ⅵ級：根莖部表皮明顯褐變，莖部褐變面積大于30%～50%，根須腐爛在50%以下，代表值3；Ⅴ級：根部明顯腐爛，莖部褐變面積大于50%，代表值4。參照張中霄[27]等人的方法計算病情指數(shù)。

1.2.4 取樣及抗性相關酶酶活性的測定 馬鈴薯糖苷生物堿誘導+接種標記為TGA，對照甲醇+接種、清水+接種分別標記為JCK、QCK，然后每5 d 10:00 定時采樣 1 次，迅速用蒸餾水將泥沙洗凈，所有采集的樣品均來自植株根部，稱取0.500 0 g用錫箔紙包好后做好標記，放入液氮中速凍，然后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

POD活性測定[28]：取樣品0.5 g加少量提取介質(含1% PVP的50 mmol/L pH 7.8 PBS)冰浴研磨勻漿，于4 ℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液即為待測酶液；反應體系：2.6 mL 0.3%愈創(chuàng)木酚、0.3 mL 0.6% H2O2、0.1 mL酶液。測定2 min內D470值的變化。(2)PPO活性測定[29]：取樣品0.5 g加2.0 mL預冷的提取緩沖液，冰浴研磨勻漿，于4 ℃下10 000 r/min離心20 min，上清液即為待測酶液；反應體系：0.1 mL酶液，2.0 mL 50 mmol/L pH7.5 PBS，0.5 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚，加入鄰苯二酚啟動反應，測定2 min內D420處吸光值變化，酶活性以每小時內吸光度變化0.01為1個活性單位(U)酶活性單位為U/(h·g)。(3)SOD活性測定[30]：取樣品0.5 g加入2.0 mL預冷的提取介質，冰浴研磨勻漿，于在4 ℃、10 000 r/min離心20 min。反應體系：1.5 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液、0.3 mL 130 mmol/L L-蛋氨酸、0.3 mL 750 μmol/L氯化硝基四氮唑藍、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2、0.5 mL蒸餾水、0.3 mL 20 μmol/L 核黃素、加入100μL酶液后在25 ℃，3 000～4 000 lx的光照20 min，測定560 nm的吸光值，酶活性采用抑制NBT光化學還原50%為SOD酶的一個活性單位(U)表示。(4)PAL活性測定[28]：取樣品0.5 g加5.0 mL提取介質(含0.05 mol/L硼酸緩沖液、2% PVP、5.0 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA-Na2)，冰浴研磨勻漿，于4 ℃、10 000 r/min下離心20 min；反應體系：1.0 mL酶液，加入1.0 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸，2.0 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液，1.0 mL蒸餾水，對照以提取介質為底物，不加L-苯丙氨酸，搖勻后置于30 ℃水浴保溫60 min，加0.2 mL 6 mol/L HCL終止反應，對照管調零，測定波長290 nm的吸光度值，以每小時D290增加0.01為一個酶活性單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016、Origin 2018軟件完成，試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方差顯著性分析利用SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析和Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 誘導濃度對枸杞根腐病的誘導效果

由表1可知：質量濃度0.312 5～5.000 0 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞根腐病均具有一定的誘導效果，以2.500 0 g/mL誘導效果最顯著，其病情指數(shù)、誘導效果與對照組JCK、QCK相比差異顯著(P<0.05)；葉和根的發(fā)病指數(shù)分別為33.33和31.67，病情指數(shù)分別下降了61.54%、62.27%、62.74%、64.15%；葉和根的誘導效果分別為62.31%、64.05%。葉：處理組不同質量濃度與對照組之間的病情指數(shù)差異均顯著，且病情指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，誘導效果與病情指數(shù)呈現(xiàn)的規(guī)律成負相關；其中，JCK與QCK對照組相比，其病情指數(shù)無顯著性差異。以QCK為對照，JCK對照組對葉和根的誘導效果分別為5.16%、-0.47%，與其他處理組相比，JCK的誘抗作用較弱，說明甲醇對枸杞的影響比較小。試驗結果表明：在0.312 5～5.000 0 g/mL質量濃度范圍內，隨質量濃度的增加枸杞葉和根的病情指數(shù)基本呈現(xiàn)由大到小的規(guī)律，誘導效果呈現(xiàn)由弱變強的規(guī)律；但到一定的濃度不再增加，質量濃度5.000 0 g/mL處理下葉和根的病情指數(shù)略大于2.500 0 g/mL。綜上所述，質量濃度2.500 0 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞葉片和根部的誘導效果達62.00%以上，能夠誘導枸杞獲得系統(tǒng)抗病性。

表1 誘導濃度對枸杞根腐病的誘導效果

2.2 誘導抗性最佳間隔期與持續(xù)時間測定

由圖1可知，隨著誘導時間的遞增，質量濃度2.500 0 g/mL 馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞根腐病的誘導效果基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在30 d呈現(xiàn)略微上升的趨勢。在誘導1～35 d時間范圍內，馬鈴薯糖苷生物堿誘導枸杞抗根腐病的抗性效果在第10天達高峰，葉和根的誘導效果分別為62.20%、58.34%，第30天開始減退，因此，馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞抗根腐病的抗性最佳間隔期和持續(xù)期分別為10 d、30 d；第35天與第30天相比，其抗性效果均略有上升的趨勢，該趨勢有可能與挑戰(zhàn)接種的方式方法、機械損傷以及滯后誘導等有關。馬鈴薯糖苷生物堿誘導枸杞的抗性效果與對照JCK相比，葉和根的誘導效果均明顯增強，且在誘導1～35 d時間范圍內，JCK對枸杞的抗性效果比較弱，其病情指數(shù)之間無顯著性差異，與馬鈴薯糖苷生物堿誘導枸杞抗根腐病的抗性效果的規(guī)律基本一致?？梢?，質量濃度2.500 0 g/mL 馬鈴薯糖苷生物堿誘導枸杞根腐病的抗性最佳間隔期為10 d，抗性持續(xù)期為30 d。

TGA：馬鈴薯糖苷生物堿；JCK：甲醇對照；誘導效果均以QCK為對照進行數(shù)據(jù)分析。TGA：Potato glycoalkaloids；JCK：methanol control；The induction effect was analyzed with QCK as the control.圖1 誘導抗性最佳間隔期與持續(xù)時間的測定Figure 1 The best interval and duration of induced resistance

2.3 枸杞抗性相關酶活性的變化

2.3.1 馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞POD活性的影響 枸杞經2.500 0 g/mL的馬鈴薯糖苷生物堿誘導處理后， 其POD活性隨誘導時間的增大呈先升高后降低的趨勢，在30 d后略微上升，對照組的POD活性變化起伏不大，相對比較平緩。2.500 0 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿處理組枸杞的POD活性第10、15、20天的 POD活性均高于對照組，其余時間低于對照組；在誘導第10天，處理組的 POD 活性達到峰值為2.447 6 g/min，對照組JCK、QCK的POD 活性分別為1.799 6 g/min、1.443 3 g/min，處理組較對照組相比JCK、QCK升高了41.03%、26.47%(圖2-A)。

2.3.2 馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞PPO活性的影響 2.5 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿處理組和對照組枸杞PPO活性總體變化趨勢均表現(xiàn)為先上升后下降，與對照組的趨勢基本一致。處理組在第10天時明顯高于對照組，PPO活性達到最高，為0.029 0 g/min，而對照組JCK較處理組延遲1 d，在第15天升至最高達0.016 5 g/min，對照組JCK整體大于QCK；處理組在第10天時處理組的PPO活性分別較對照組JCK、QCK升高了63.61% 、6.77%(圖2-B)。

2.3.3 馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞SOD活性的影響 2.500 0 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿處理組和對照組枸杞SOD活性呈迅速上升又緩慢下降的趨勢，處理組的SOD活性在第5、10、15天均高于對照組。在誘導第15天時，處理組的SOD活性達到峰值，為264.147 0 U；處理組的SOD活性分別較JCK、QCK對照組升高了28.40% 和16.53%，表明馬鈴薯糖苷生物堿誘導的枸杞后表現(xiàn)出了一定的抗性(圖1-C)。

2.3.4 馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞PAL活性的影響 2.500 0 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿處理枸后，PAL被誘導激活，活性增強，誘導第1天、30天處理組PAL活性低于JCK、QCK對照組，其余時間處理組均高于JCK對照組，其中，誘導第25天對照組PAL活性略低于處理組；處理組的PAL活性在第1天略有下降，至第5天迅速上升，第10天達到最高峰，為5 007.952 6 U，較JCK、QCK對照組分別提高了18.73%、19.06%，之后有所降低，但均高于對照組而對照組的PAL活性變化趨勢不明顯，變動幅度較小且趨于平緩(圖1-D)。

TGA：馬鈴薯糖苷生物堿；JCK：甲醇對照；誘導效果均以QCK為對照進行數(shù)據(jù)分析。TGA：Potato glycoalkaloids；JCK：methanol control；The induction effect was analyzed with QCK as the control.圖2 馬鈴薯糖苷生物堿誘導對枸杞抗性相關酶活性的影響Figure 2 Potato glycoalkaloids inductionon the activities of resistance related enzymerelated toLycium barbarum

3 討論

馬鈴薯糖苷生物堿是一種具有多種功能植物源活性物質，具有低殘留，對非靶標生物安全和不易產生抗藥性等優(yōu)點[31]。而且由于植物自身存在化學防御物質，該物質能通過防御相關基因的增強表達和抗病性相關化合物的增量合成提高植物的抗病性[32]。誘導因子施用的時機和濃度會直接影響誘導植物抗性的效果。誘導抗性只有發(fā)生在誘導物最適濃度、誘導間隔最大期時才能發(fā)揮最大效率。研究表明，不同濃度馬鈴薯糖苷生物堿可降低枸杞根和葉的病情指數(shù)，具有誘導枸杞對根腐病的抗性效應，且全株表現(xiàn)出系統(tǒng)抗病性；且誘導效果隨著挑戰(zhàn)接種時間間隔的延長呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞根腐病的抗性最佳間隔期為10 d、誘導抗性持續(xù)期為30 d。

本研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯糖苷生物堿2.500 0 g/mL誘導效果最好，當濃度高于2.500 0 g/mL時，誘導效果則有所下降。表明在一定的濃度范圍內，誘導劑可能與其誘導植物獲得的抗病性呈正相關，當誘導劑濃度達到一定閾值時，能夠充分激活植株體的相關抗病防御機制，但超過該濃度范圍時，誘導劑對植株的誘導效果誘導效應不再增強反而降低誘導抗性的有效性，與王守正[33]、Dean等[34]的研究結果一致；與這可能與較高濃度的生物堿影響或干預了植株的正常代謝，甚至產生藥害，影響植株的正常生長。許多研究表明，誘導處理和挑戰(zhàn)接種的時間間隔長短會影響到誘導抗性的表現(xiàn)和誘導效果的好壞，這與植物對誘導刺激發(fā)生免疫應答或基因敏化需要一定的時間間隔有關，同時，這種時間間隔還因不同植物病害系統(tǒng)和誘導物的種類而異[35]。本試驗中枸杞經馬鈴薯糖苷生物堿處理后不僅誘發(fā)地下部分的抗性，而且未處理的地上部分也表現(xiàn)出抗性，這說明馬鈴薯糖苷生物堿誘導枸杞對根腐病的抗性具有系統(tǒng)性，與植物獲得系統(tǒng)性抗性的研究結果[36]一致。

在應用生物和非生物源誘導抗性因子處理植株后，可誘導植株對病原菌產生全面、系統(tǒng)的抗病性，這種抗病性的產生涉及多方面的變化，主要包括組織形態(tài)學和生理生化等方面的變化，從而產生對病原菌的抗性，提高植株的抗病能力。如Yang等[37]從石蒜中分離出的生物堿能提高抗性相關酶PAL、POD、SOD的活性，提高煙草的抗病性。另外，茉莉酸處理枸杞幼苗后7 d枸杞葉POD、PAL活性以及單寧的含量的增加，可以提高抗病性[38]。在本試驗中，以2.500 0 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿處理枸杞后，PPO、POD、PAL和SOD 4種與抗性相關酶的活性均有不同程度的提高，增加的幅度高于對照組，表明馬鈴薯糖苷生物堿誘導枸杞抗根腐病可能與抗性相關酶酶活性的升高有關，且隨著誘導時間的延長，處理組的酶活性均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，對照組酶活的趨勢相對比較平緩。但酶的活性易受處理方式造成的機械損傷、處理濃度和處理環(huán)境條件等因素影響，導致馬鈴薯糖苷生物堿的誘抗效果有所差異，在研究過程中應以上述因素為參照，構建切實、可行的應用體系。

4 結論

不同供試濃度馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞根腐病均具有一定的誘抗效果，與對照相比，以2.500 0 g/mL馬鈴薯糖苷生物堿誘導處理后的枸杞葉片和根部病情指數(shù)最低，誘抗效果最強；在此最佳供試濃度下誘導處理枸杞后，其最佳誘導間隔期和誘導抗病持續(xù)期分別為10 d和30 d；且枸杞植株體內酶活變化明顯，在一定誘導時間范圍內，隨著誘導時間的增加，PPO、POD、PAL和SOD抗性相關酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并較對照有不同程度的升高，表明馬鈴薯糖苷生物堿可有效誘導枸杞抗根腐病，其誘導抗性與其激活枸杞抗性相關酶活性有關。另外，植物誘導抗性的反應還與其他抗性相關酶活性、代謝物質及病程相關蛋白的變化有關，也將是該試驗進一步研究的重點內容。植物誘導抗病性的研究不僅可以揭示植物和微生物之間復雜的互作關系，具有十分重要的理論價值，而且對植物病害的防治工作也具有重要的應用價值和現(xiàn)實意義。植物誘導劑對環(huán)境無污染，有利于維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡，同時也可促進我國農業(yè)朝著可持續(xù)農業(yè)的方向發(fā)展，有著許多化學藥劑無可比擬的優(yōu)點，植物誘導抗性已成為植物病理學科的研究熱點，未來極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>