袁宗勝

摘要 研究了毛竹內生拮抗細菌JL-B05和JL-B16對3種食用菌病原菌的生防機理。結果表明，不同濃度內生拮抗細菌過濾液和滅菌液對病原菌菌絲生長均具有顯著的抑制效果，其中濃度為20%的內生拮抗細菌JL-B05過濾液對病原菌菌絲生長的抑制效果最好，對疣孢病菌的抑制率達86.37%，對油疤病菌的抑制率為78.81%，對蛛網病菌的抑制率為76.76%，抑制效果均優(yōu)于內生拮抗細菌JL-B16過濾液。濃度為20%的內生拮抗細菌JL-B16滅菌液對油疤病菌菌絲生長的抑制率為72.11%，對疣孢病菌抑制率為62.51%，對蛛網病菌的抑制率為61.88%，抑制效果均優(yōu)于內生拮抗細菌JL-B05滅菌液。在內生拮抗細菌發(fā)酵液和滅菌液對病原菌孢子萌發(fā)抑制效果測定中，濃度為40%內生拮抗細菌JL-B05、JL-B16過濾液和滅菌液對3個病原菌的抑制效果均較為顯著。內生細菌JL-B05、JL-B16揮發(fā)性物質對病原菌菌絲生長均表現出一定的抑制作用。

關鍵詞 毛竹;內生拮抗細菌;食用菌病害;生防機理

中圖分類號 S 476? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）08-0126-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.034

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

The Biological Control Mechanism of Endophytic Antagonistic Bacteria in Phyllostachys edulis on Edible Fungi Diseases

YUAN Zong-sheng

（Institute of Oceanography， Minjiang University， Fuzhou， Fujian? 350108）

Abstract The biological control mechanism of endophytic antagonistic bacteria JL-B05 and JL-B16 against three edible fungus pathogens was studied. The results showed that different concentrations of endophytic antagonistic bacterial filtration solution and sterilized solution had significant inhibitory effect on the growth of pathogenic mycelia， among which the 20% endophytic antagonistic bacteria JL-B05 filtration solution had the best inhibitory effect on the growth of pathogenic mycelia， the inhibition rate of Mycogone perniciosa was 86.37%， the inhibition rate of Scytalidium lignicola was 78.81%， the inhibition rate of Cladobotryum semicirculare was 76.76%， and the overall inhibition effect was better than that of endophyte JL-B16 filtration solution. The inhibition rate of endophytic antagonistic bacteria JL-B16 sterilized solution with concentration of 20% on mycelial growth of Scytalidium lignicola was 72.11%，62.51% on Mycogone perniciosa and 61.88% on Cladobotryum semicirculare， and the overall effect was better than that of endophytic antagonistic bacteria JL-B05 sterilized solution. In the determination of the inhibitory effect of endophytic antagonistic bacterial filtration solution and sterilized solution on the spore germination of pathogenic bacteria， the concentration of 40% endophytic antagonistic bacteria JL-B05， JL-B16 filter solution and sterilized solution on the three pathogens was more significant. Endophytic bacteria JL-B05， JL-B16 volatile substances also showed a certain inhibition on the growth of pathogenic mycelia.

Key words Phyllostachys edulis;Endophytic antagonistic bacteria;Edible fungi disease;Biological control mechanism

植物內生細菌指其生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內部，并與植物建立了和諧聯合關系的細菌 [1]。植物內生菌能夠引起廣泛關注主要是由于它能夠產生多種多樣的具有農藥活性的次生代謝產物 [2]，在自然界中具有重要的生態(tài)學作用。內生細菌通過自身產生代謝產物或借助信號轉導對宿主植物生長發(fā)育產生重要影響，主要在促進宿主植物生長、增強宿主植物抗性及提高植物修復能力等方面 [3-7]，如Microbacterium具有促進植物生長的作用 [8]，Bacillus具有良好的生防潛力 [9]，Sphingomonas具有植物自我修復功能 [10]等。內生菌對植物病害的防病機理主要是通過幾個方面：一產生抗生素類物質，在低濃度下可以對微生物產生影響 [11];二產生水解酶，可降解某些致病因子 [12];三產生生長調節(jié)劑 [13]，內生菌也可以產生植物生物激素類物質促進植物生長;四內生菌與病原菌競爭營養(yǎng)物質，使病原菌得不到必要的營養(yǎng)供給而死亡以及增強宿主植物的抵抗力以及誘導植物產生系統抗性等途徑抑制病原菌的生長 [14]。

我國食用菌產業(yè)在近30年發(fā)展迅速，但在食用菌生產栽培過程中，常受到害蟲和病菌的危害，據不完全統計，由于病蟲的危害導致減產10%～30%，嚴重的情況下甚至會顆粒無收 [15]。防治病蟲害最常見的方法是化學藥劑，但長時間使用單一的化學藥劑會使得病蟲害的抗性增強，防治效果下降，而且藥品的殘留量會對身體健康造成威脅，也會導致嚴重的環(huán)境污染，生物防治則具有許多優(yōu)點，因此近幾年受到了世界各地的普遍重視 [16]。國內外研究者在內生菌對于防治植物病害方面進行了大量研究，也取得了非常顯著的效果。但內生菌在食用菌病害防治方面研究較少，因此，筆者選取對主要食用菌病原菌（疣孢病菌、蛛網病菌、油疤病菌）具有較好拮抗效果的內生細菌菌株JL-B05、JL-B16，研究其對食用菌病害的生防機理，將對食用菌病害的生物防治及促進食用菌產業(yè)的良性發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

1.1.1 內生拮抗細菌。內生細菌菌株JL-B05、JL-B16，由筆者所在實驗室從毛竹竹鞭中分離并篩選出對食用菌主要病原菌具有較好拮抗效果的內生細菌。

1.1.2 食用菌病原菌。疣孢病菌，疣孢霉（Mycogone perniciosa）;蛛網病菌，葡枝霉（Cladobotryum semicirculare）;油疤病菌，木棲柱孢霉（Scytalidium lignicola）。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

內生細菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2（液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）。

LB液體培養(yǎng)基，主要成分是酵母粉、氯化鈉、胰蛋白胨;PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g。

所用試劑均為國產分析純。

1.3 內生拮抗細菌發(fā)酵過濾液和發(fā)酵滅菌液的制備

1.3.1 內生拮抗細菌發(fā)酵過濾液的制備。

取供試內生拮抗細菌JL-B05、JL-B16，分別用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為 100 mL 的LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，通過離心（4 ℃，10 000 r/ min，15 min）取得上清液，在無菌條件下，經 0.22 μm 微孔濾膜過濾后所得濾液，即為內生拮抗細菌發(fā)酵過濾液。

1.3.2 內生拮抗細菌發(fā)酵滅菌液的制備。

取供試內生拮抗細菌JL-B05、JL-B16，分別用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為 100 mL 的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，放入高壓滅菌鍋，121 ℃條件下滅菌30 min，即為內生拮抗細菌發(fā)酵滅菌液。

1.4 內生拮抗細菌的生防機理

1.4.1 內生拮抗細菌發(fā)酵過濾液對病原菌菌絲生長的影響。

采用菌落生長法測定內生拮抗細菌過濾液的抑菌活性，將上述內生拮抗細菌過濾液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加過濾液的PDA平板為對照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個處理3次重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長狀況，待對照CK滿板時采用十字交叉法測量菌絲直徑。

采用下列公式計算抑制率：

相對抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.4.2 內生拮抗細菌發(fā)酵滅菌液對病原菌菌絲生長的影響。

采用菌落生長法測定內生拮抗細菌滅菌液的抑菌活性，將上述內生拮抗細菌滅菌液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加滅菌液的PDA平板為對照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個處理3次重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長狀況，待對照CK滿板時采用十字交叉法測量菌絲直徑。

采用下列公式計算抑制率：

相對抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.4.3 內生拮抗細菌發(fā)酵過濾液對病原菌孢子萌發(fā)的影響。

取上述內生拮抗細菌JL-B05、JL-B16過濾液，將過濾液按照20%、40%這2個比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長成熟的3個病原菌的培養(yǎng)皿中加入無菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液。然后用移液槍將孢子懸浮液加入上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個處理3次重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況。

采用下列公式計算抑制率：

相對抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.4.4 內生拮抗細菌發(fā)酵滅菌液對病原菌孢子萌發(fā)的影響。

取上述內生拮抗細菌JL-B05、JL-B16滅菌液，將滅菌液按照20%、40%這2個比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長成熟的3個病原菌的培養(yǎng)皿中加入無菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液。然后用移液槍將孢子懸浮液加入上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個處理3次重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況。

采用下列公式計算抑制率：

相對抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.4.5 內生拮抗細菌揮發(fā)性物質對病原菌菌絲生長的影響。

將3個病原菌菌株（疣孢病菌、蛛網病菌、油疤病菌）和內生拮抗細菌菌株JL-B05、JL-B16分別轉接到不同的PDA平板上，并分別在適宜的溫度條件下培養(yǎng)2 d后在無菌條件下，去掉平板蓋，將接有病原菌的培養(yǎng)皿相對扣合，并用封口膜沿邊緣封口，防止揮發(fā)性物質漏出。以不接內生拮抗細菌的作為對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每個處理3個重復。觀察病原菌的菌絲生長情況并計算抑菌率。

采用下列公式計算抑制率：

相對抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.5 數據統計與分析

數據統計繪圖用Excel，數據統計分析采用 DPS（V7.05）的相應分析功能進行。

2 結果與分析

2.1 內生拮抗細菌發(fā)酵過濾液對病原菌菌絲生長的抑制效果

通過對病原菌菌絲生長情況進行觀察，統計不同種不同比例內生菌過濾液對病原菌的抑制率，結果見表1。從表1可以看出，內生拮抗細菌JL-B05對疣孢病菌的抑制效果最好，且效果最佳菌液濃度為20%。菌液濃度為20%內生拮抗細菌JL-B16對油疤病菌原菌的抑制效果最好。

2.2 內生拮抗細菌發(fā)酵滅菌液對病原菌菌絲生長的抑制效果

通過對病原菌菌絲生長情況進行觀察，統計不同種不同比例內生菌滅菌液對病原菌的抑制率，結果見表2。從表2可以看出，濃度為20%的內生拮抗細菌JL-B05滅菌液對病原菌的抑制效果最佳，其中濃度為20%內生拮抗細菌JL-B05和JL-B16滅菌液均對油疤病菌表現出較好的抑制效果，其次是疣孢病菌、蛛網病菌。

2.3 內生拮抗細菌發(fā)酵過濾液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果

通過對病原菌孢子萌發(fā)生長情況進行觀察，統計不同種內生菌過濾液對病原菌的抑制率，結果見表3。從表3可以看出，內生拮抗細菌JL-B05過濾液對病原菌的抑制效果較好，濃度為40%的內生拮抗細菌JL-B05和JL-B16對于3個病原菌都很理想，都能較好地抑制孢子的萌發(fā)。

2.4 內生拮抗細菌發(fā)酵滅菌液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果

通過對病原菌孢子萌發(fā)生長情況進行觀察，統計不同種內生菌滅菌液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果，結果見表4。從表4可以看出，濃度為40%內生拮抗細菌JL-B05和JL-B16發(fā)酵滅菌液對病原菌的抑制效果較好。濃度為40%的內生拮抗細菌JL-B16發(fā)酵滅菌液對病原菌的抑制效果較好，對疣孢病菌和油疤病菌的抑制效果最佳。

2.5 內生拮抗細菌揮發(fā)性物質對病原菌菌絲生長的抑制效果

通過觀察病原菌與內生拮抗細菌對密封培養(yǎng)皿中病原菌的菌絲生長狀況，結果表明，內生拮抗細菌揮發(fā)性物質對病原菌菌絲生長具有一定的抑制作用。從表5可以看出，內生拮抗細菌JL-B05和JL-B16的揮發(fā)性物質對于油疤病菌、蛛網病菌的抑制效果較好，對于疣孢病菌的抑制效果相對較弱。

3 結論與討論

從內生拮抗細菌對3種食用菌病原菌的生防效果可以看出，不同濃度內生拮抗細菌過濾液和滅菌液對病原菌菌絲生長均具有一定的抑制效果。其中濃度為20%的內生拮抗細菌JL-B05過濾液對病原菌的抑制效果最好，對疣孢病菌的抑制率達86.37%，對油疤病菌的抑制率為78.31%，對蛛網病菌的抑制率為76.76%。濃度為20%的內生拮抗細菌JL-B16滅菌液對病原菌菌絲生長的抑制效果最好，對油疤病菌的抑制率達72.11%，對疣孢病菌的抑制效果為62.51%，對蛛網病菌的抑制率為61.88%。

不同濃度內生拮抗細菌過濾液和滅菌液對病原菌孢子萌發(fā)的測定中，濃度為40%內生拮抗細菌JL-B05、JL-B16對3個病原菌的抑制效果都非常明顯。內生拮抗細菌揮發(fā)性物質對病原菌菌絲生長也表現出一定的抑制作用，對于疣孢病菌的整體抑制效果低于50%，JL-B16對于蛛網病菌和油疤病菌的抑制效果相對較好。從上述分析可以看出內生拮抗細菌JL-B05、JL-B16對3個病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均表現出一定的抑制效果。

內生菌對植物病害的生物防治已研究多年并取得了很好的應用效果，何紅等 [17]也證明分離自辣椒的內生芽孢桿菌對辣椒炭疽病菌有拮抗活性。用植物內生的枯草芽孢桿菌處理辣椒苗，然后再接種病原菌，能夠將發(fā)病率降低81.49%～93.34%。內生菌的拮抗效果除實驗室的抑菌效果測定外，還需要進行大田生產過程中的實際應用，以進一步驗證內生菌的拮抗效果。研究表明植物內生細菌是一個很好的外源基因載體，利用分子生物技術構建工程內生細菌的研究工作在國內外已相繼開展，快速發(fā)展，并取得許多成功的報道，如抗蟲工程菌、防病工程菌、固氮工程菌等，這將是今后內生細菌的研究熱點。

參考文獻

[1] 胡桂萍，鄭雪芳，尤民生，等.植物內生菌的研究進展[J].福建農業(yè)學報，2010，25（2）：226-234.

[2] 施躍峰.試論生物農藥產業(yè)及其在我國的發(fā)展策略[J].安徽農學通報，2004，10（4）：40-41.

[3] 徐亞軍.植物內生菌資源多樣性研究進展[J].廣東農業(yè)科學，2011，38（24）：149-152.

[4] 國輝，毛志泉，劉訓理.植物與微生物互作的研究進展[J].中國農學通報，2011，27（9）：28-33.

[5] 盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君.植物內生細菌的分離、分類、定殖與應用[J].生命科學，2006，18（1）：90-94.

[6] RYAN R P，GERMAINE K，FRANKS A，et al.Bacterial endophytes：Recent developments and applications[J].FEMS Microbiol Lett，2008，278（1）：1-9.

[7] MELNICK R L，ZIDACK N K，BAILEY B A，et al.Bacterial endophytes：Bacillus spp.from annual crops as potential biological control agents of black pod rot of cacao[J].Biol Cont，2008，46（1）：46-56.

[8]? SHENG X F，XIA J J，JIANG C Y，et al.Characterization of heavy metalresistant endophytic bacteria from rape（Brassica napus）roots and their potential in promoting the growth and lead accumulation of rape[J].Environ Pollut，2008，156（3）：1164-1170.

[9]? BERG G，HALLMANN J.Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes[M]//SCHULZ B J E，BOYLE C J C，SIEBER T N，et al.Microbial root endophytes.Berlin，Germany：Springer Verlag，2006：53-69.

[10]? ULRICH K，ULRICH A，EWALD D.Diversity of endophytic bacterial communities in poplar grown under field conditions[J].FEMS Microbiol Ecol，2008，63（2）：169-180.

[11] STURZ A V，CHRISTIE B R，MATHESON B G，et al.Endophytic bacterial communities in the periderm of potato tubers and their potential to improve resistance to soil-borne plant pathogens[J].Plant Pathol，1999，48（3）：360-369.

[12] VELAZHAHAN R，SAMIYAPPAN R，VIDHYASEKARAN P.Relationship between antagonistic activities of Pseudomonas fluorescens isolates against Rhizoctonia solani and their production of lytic enzymes[J].Zeitschrift fur pflanzenkrankheiten und pflanzenschutz，1999，106（3）：244-250.

[13] STURZ A V，CHRISTIE B R，NOWAK J.Bacterial endophytes：Potential role in developing sustainable systems of crop production[J].Crit Rev in Plant Sci，2000，19（1）：1-30.

[14] 竇瑞木.3株植物內生細菌對番茄灰霉病的防治效果[J].河南農業(yè)科學，2010，39（4）：77-78，97.

[15] 張超.華重樓拮抗內生細菌的篩選、鑒定及其拮抗物質的初步研究[D].成都：四川師范大學，2008.

[16] 王玉霞，李晶，張淑梅，等.芽孢桿菌對黃瓜根腐病的防治效果[J].生物技術，2004，14（3）：57.

[17] 何紅，邱思鑫，胡方平，等.植物內生細菌生物學作用研究進展[J].微生物學雜志，2004，24（3）：40-45.