范土貴，曹笑皇，趙云濤，高加龍，劉穎，劉海，鐘賽意，秦小明，陳建平*

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院， 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室, 廣東省海洋食品工程 技術(shù)研究中心, 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江，524088) 2(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心(大連工業(yè)大學(xué))，遼寧 大連，116034)3(玉林師范學(xué)院 化學(xué)與 食品科學(xué)學(xué)院，廣西 玉林，537000)4(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江，524088)

長(zhǎng)期及過(guò)量飲酒會(huì)引起人體肝臟的酒精性損傷，其最初表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，嚴(yán)重情況下會(huì)發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，最終引發(fā)肝癌[1]。目前全球約有5.3%的死亡與長(zhǎng)期及過(guò)量飲酒有關(guān)，并且我國(guó)酒精性肝損傷的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，已嚴(yán)重威脅到人類的健康[2]。長(zhǎng)期及過(guò)量飲酒會(huì)顯著降低線粒體中乙醛脫氫酶的活力，導(dǎo)致乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛在肝臟中不斷地累積。乙醛在肝臟中堆積會(huì)對(duì)肝臟中的線粒體結(jié)構(gòu)和微管系統(tǒng)進(jìn)行破壞，抑制肝臟中微粒蛋白的分泌與合成，從而導(dǎo)致蛋白和脂質(zhì)在肝臟中的累積[3]。乙醛還會(huì)顯著提高肝臟內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平，ROS會(huì)破壞肝臟的氧化還原穩(wěn)態(tài)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肝臟損傷[4]。因此，如何能夠有效地保護(hù)肝臟免受酒精性損傷已成為目前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

姜黃素(curcumin，CUR)是一種從姜科姜黃屬植物根莖中提取得到的脂溶性多酚類物質(zhì)，其分子式為C21H20O6[5]。目前，姜黃素在食品工業(yè)中常用于制備香料、色素和抗氧化劑等食品添加劑，廣泛應(yīng)用于糕點(diǎn)、罐頭、飲料等食品中。相關(guān)研究表明，姜黃素能夠有效地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，能提高細(xì)胞內(nèi)相關(guān)抗氧化物質(zhì)的表達(dá)量，能促進(jìn)機(jī)體維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)[6]。另外，姜黃素具有很好的護(hù)肝效應(yīng)，可降低酒精、四氯化碳、硫代乙酰胺等各種化學(xué)藥物引起的肝損傷[7-8]。但是，姜黃素的水溶性及生物利用度極低，這極大地限制了其在酒精性肝損傷防治方面的應(yīng)用。為此本課題組在前期研究中利用β-環(huán)糊精聚合物(β-cyclodextrin polymer, CDP)作為載體，通過(guò)超分子化學(xué)作用制備得到了水溶性和抗氧化活性良好的CUR/CDP，并發(fā)現(xiàn)CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，能夠顯著提高乙醇損傷后LO2細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力，并且顯著降低LO2細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS的含量[9-11]。然而，關(guān)于其具體的保護(hù)作用機(jī)制尚未明晰。故在前期研究的基礎(chǔ)上，本文通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和ROS檢測(cè)試劑盒考察CUR/CDP改善乙醇誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，為其在保護(hù)酒精性肝損傷中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素超分子包合物，實(shí)驗(yàn)室自制；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞裂解液RAPI、BCA蛋白測(cè)試盒和ROS檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE電泳液(Tris-Gly, Powder)、Western轉(zhuǎn)膜液、TBSTw (TBS with Tween-20)、Western封閉液、Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠免疫球蛋白G(immunoglobulins G,IgG)(H+L)(HRP-labeled Goat Anti-Rat IgG(H+L)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)和BeyoGelTMPlus PAGE預(yù)制膠(Tris-Gly, 8%, 10孔)，碧云天生物技術(shù)有限公司；β-Actin抗體(C4)、p-MDM2抗體(2G2)、cyclin B1抗體(GNS1)、p-ATM抗體(10H11.E12)、p53抗體(DO-1)、γ-H2AX抗體(Ser 139)和p-p38 MAPK抗體(D-8)，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；Phospho-p53 (Ser15)，美國(guó)Antibody Cell signaling technology公司；重組Anti-p21抗體[EPR362]，英國(guó)Abcam公司。胎牛血清、PBS、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液和雙抗溶液，美國(guó)Gibco公司；LO2 細(xì)胞，美國(guó)ATCC公司；分析純?chǔ)?環(huán)糊精，山東新大精細(xì)化工有限公司；其他化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AUW120電子天平，日本島津公司；XRDKQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；DZF-6050真空干燥箱，上海一恒科學(xué)有限公司；HL-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；FD8508真空冷凍干燥機(jī)，韓國(guó)ilshin公司；FACS Aria流式細(xì)胞儀，美國(guó)Waters公司；Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CUR/CDP的制備

CUR/CDP的具體制備方法參考CHEN等[9]的方法進(jìn)行。稱取15.76 g NaOH和20 g β-環(huán)糊精，加入32 mL H2O攪拌溶解，在30 ℃下緩慢加入環(huán)氧氯丙烷9.64 mL，攪拌24 h后，冷卻至室溫。經(jīng)超聲功率為80 W超聲5 min后，將溶液倒入透析袋中透析至中性，抽濾去除不溶物，經(jīng)0.45 μm纖維素膜過(guò)濾后旋蒸至黏稠狀，加入無(wú)水乙醇析出白色固體，經(jīng)過(guò)濾、真空干燥即得β-環(huán)糊精聚合物。將姜黃素和β-環(huán)糊精聚合物按質(zhì)量比1∶4 研磨混勻，加入50 mL蒸餾水，在120 W下超聲5 min后，經(jīng)磁力攪拌2 d，將溶液抽濾、旋蒸和真空干燥，即得水溶性姜黃素超分子包合物。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

LO2細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗溶液)中，并將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后細(xì)胞周期的影響

將密度為2×105個(gè)細(xì)胞/mL的LO2細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，經(jīng)10～80 μg/mL CUR/CDP處理細(xì)胞12 h后，去除培養(yǎng)基，加入5 mL 600 mmol/L乙醇培養(yǎng)細(xì)胞6 h。然后，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后置于1 000 r/min下離心5 min，棄上清液，加入1 mL 70%冰乙醇，重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液置于-20 ℃冰箱中過(guò)夜，次日，經(jīng)1 000 r/min下離心5 min、棄上清液后，加入500 μL PI染料避光染色20 min后用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

密度為2×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞經(jīng)10～80 μg/mL CUR/CDP處理12 h和5 mL 600 mmol/L乙醇處理6 h后，棄培養(yǎng)基，加入RIPA裂解液冰上孵育 30 min，4 ℃，10 000 r/min 離心30 min，取上清液得到蛋白樣品，并用BCA試劑盒測(cè)其蛋白濃度。取25 μL 5×蛋白上樣緩沖液于100 mL樣品中，混勻后于95 ℃下加熱5 min。然后，將混合樣品經(jīng)SDS-PAGE后，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)Western封閉液封閉2 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min。加入目標(biāo)蛋白抗體，振蕩過(guò)夜。次日回收一抗，用TBST洗膜3次，每次5 min。再加入HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，回收二抗，用TBST洗膜3次，每次 5 min。用ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，在Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行拍照，以β-actin作為內(nèi)參。

1.3.5 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)ROS熒光強(qiáng)度變化的影響

將LO2細(xì)胞以10×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于24孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后，經(jīng)10～80 μg/mL CUR/CDP培養(yǎng)12 h后用移液器去除培養(yǎng)液，加入1 mL 600 mmol/L乙醇培養(yǎng)6 h后，加入500 μL 濃度為10 μmol/L的DCFH-DA孵育30 min。用PBS洗滌3次，采用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察及拍照。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞周期變化的影響

本課題組前期研究表明，CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用[10]。為了進(jìn)一步闡明其相關(guān)的保護(hù)作用機(jī)制，本文采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、圖2所示。由圖1可知，空白對(duì)照組中細(xì)胞內(nèi)G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)目分別為(56.04±0.57)%、(35.13±0.46)%、(8.83±0.46)%。而乙醇處理組中細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)目從空白對(duì)照組的(56.04±0.57)%降低到(39.43±0.60)%，G2/M期的細(xì)胞數(shù)目從空白對(duì)照組的(8.83±0.46)%提高到(21.86±0.13)%。這表明細(xì)胞經(jīng)乙醇處理后能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期細(xì)胞周期阻滯，使得G0/G1期細(xì)胞數(shù)目顯著減少。而經(jīng)10～80 μg/mL CUR/CDP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，能顯著降低乙醇誘導(dǎo)的G2/M阻滯，細(xì)胞數(shù)量分別從乙醇處理組的(21.86±0.13)%分別下降到(14.11±0.47)%、(11.75±0.32)%、(6.64±0.55)%和(4.76±0.36)%。上述結(jié)果表明，CUR/CDP能夠通過(guò)降低G2/M期細(xì)胞數(shù)量來(lái)改善乙醇誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞損傷。

a-空白對(duì)照組；b-乙醇處理組；c-10 μg/mL CUR/CDP+乙醇組；d- 20 μg/mL CUR/CDP +乙醇組；e- 40 μg/mL CUR/CDP+乙醇組； f- 80 μg/mL CUR/CDP +乙醇組圖1 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞周期分布的影響Fig.1 Effects of CUR/CDP pretreatment on ethanol-induced cell cycle distribution

2.2 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白cyclin B1及p21蛋白變化的影響

眾所周知，細(xì)胞周期是指細(xì)胞從上一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束的全過(guò)程，是機(jī)體細(xì)胞正常生長(zhǎng)中的基本過(guò)程，主要由DNA合成以及細(xì)胞分裂組成，其可分為G1期、S期、G2期和M期[13]。機(jī)體細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程會(huì)嚴(yán)格受到細(xì)胞周期蛋白(cyclin)與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)復(fù)合物的嚴(yán)格調(diào)控[14]。cyclin通過(guò)與相應(yīng)的CDK結(jié)合形成cyclin-CDK復(fù)合物從而將CDK激活，進(jìn)而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。其中，細(xì)胞周期由G2期向M期的轉(zhuǎn)換進(jìn)程是由cyclin B1-CDK1復(fù)合物嚴(yán)格調(diào)控的，而CDK1活性需要依賴cyclin B1含量的積累，即只有cyclin B1含量積累到一定程度時(shí)，與CDK1結(jié)合后激活CDK1，從而cyclin B1-CDK1復(fù)合物的活性才會(huì)被激活[15]。研究發(fā)現(xiàn)，cyclin-CDK復(fù)合物的活性會(huì)受到CDK抑制劑Cip/Kip家族蛋白如p21等的負(fù)向調(diào)節(jié)，Cip/Kip家族蛋白主要是通過(guò)抑制cyclin-CDK復(fù)合物的活性將細(xì)胞周期阻滯停留在某一時(shí)期[16]。p21是一種G2/M期周期蛋白依賴性激酶抑制因子，能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性，阻止其發(fā)揮作用，從而引起機(jī)體細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯[17]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究進(jìn)一步采用Western blot技術(shù)檢測(cè)了與G2/M阻滯相關(guān)的p21和cyclin B1蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，相比空白對(duì)照組，乙醇處理組中p21的蛋白表達(dá)量從空白對(duì)照組的(60.28±3.99)%升高至(100.00±1.50)%，而細(xì)胞周期蛋白cyclin B1的表達(dá)量從空白對(duì)照組的(100.00±1.50)%降低至(26.01±7.84)%。經(jīng)不同濃度的CUR/CDP處理后，能夠顯著下調(diào)乙醇誘導(dǎo)的p21蛋白表達(dá)量的上升并上調(diào)乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白cyclin B1表達(dá)量的下降。上述結(jié)果表明，CUR/CDP能夠通過(guò)抑制p21蛋白的表達(dá)和促進(jìn)cyclin B1的表達(dá)使得G2/M細(xì)胞數(shù)量減少?gòu)亩纳埔掖颊T導(dǎo)的G2/M細(xì)胞周期阻滯。

A-空白對(duì)照組；B-乙醇處理組；C-10 μg/mL CUR/CDP+乙醇組； D-20 μg/mL CUR/CDP+乙醇組；E-40 μg/mL CUR/CDP+乙醇組； F-80 μg/mL CUR/CDP+乙醇組(下同)圖2 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)不同細(xì)胞周期中細(xì)胞含量的影響Fig.2 Effect of CUR/CDP pretreatment on cell content in different cell cycles 注：不同小寫字母間存在顯著差異(P<0.05)(下同)

a-不同處理組的cyclinB1和p21蛋白條帶;b-不同處理組的cyclin B1蛋白表達(dá)水平;c-不同處理組的p21蛋白表達(dá)水平圖3 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇損傷LO2細(xì)胞的cyclin B1及p21蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of CUR/CDP pretreatment on the expression levels of cyclin B1 and p21 proteins in ethanol injured LO2 cells

2.3 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)DNA損傷及其調(diào)控蛋白表達(dá)水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DNA受到損傷無(wú)法及時(shí)修復(fù)DNA時(shí)，會(huì)引發(fā)細(xì)胞周期無(wú)法從一個(gè)階段向下一個(gè)階段轉(zhuǎn)變，從而引起細(xì)胞周期阻滯[18]。DNA受到損傷后，與DNA關(guān)聯(lián)密切的H2AX會(huì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致H2AX的磷酸化形成γ-H2AX。故γ-H2AX被認(rèn)為是機(jī)體組織及細(xì)胞中DNA受到損傷的特定標(biāo)志物之一[19]。此外，細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷會(huì)引起ATM蛋白磷酸化水平的升高從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或阻滯[20]。故本文運(yùn)用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)與DNA損傷相關(guān)的γ-H2AX和p-ATM蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，相比空白對(duì)照組，乙醇處理后能顯著上調(diào)與DNA損傷有關(guān)的下游蛋白p-ATM和γ-H2AX的表達(dá)量，表明乙醇作用于LO2細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)DNA受到損傷導(dǎo)致其下游蛋白表達(dá)量的升高。而經(jīng)不同濃度的CUR/CDP處理后，p-ATM和γ-H2AX的蛋白表達(dá)量從乙醇處理組的(100.00±1.50)%和(100.00±1.50)%分別下降到(83.22±1.80)%、(63.47±4.80)%、(47.96±2.32)%、(37.11±2.09)%和(85.40±4.63)%、(73.82±5.44)%、(50.21±1.78)%和(41.90±4.15)%。上述結(jié)果表明，經(jīng)CUR/CDP處理細(xì)胞后能減輕細(xì)胞內(nèi)乙醇誘導(dǎo)的DNA損傷。

a-不同處理組的γ-H2AX和p-ATM蛋白條帶;b-不同處理組的γ-H2AX蛋白表達(dá)水平;c-不同處理組的p-ATM蛋白表達(dá)水平圖4 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)DNA損傷的相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of CUR/CDP pretreatment on expression levels of DNA damage-related regulation proteins induced by ethanol

2.4 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)p53及其上游蛋白表達(dá)水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)，p53是一種腫瘤抑制因子，DNA損傷可以使p53發(fā)生磷酸化，磷酸化后的p53能夠通過(guò)激活p21蛋白抑制cyclin-CDK復(fù)合物的活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯[21]。同時(shí)，DNA損傷也能導(dǎo)致MDM2含量減少，后者能夠催化p53單泛素化和多泛素化導(dǎo)致p53降解，從而誘導(dǎo)p53失活[22]。此外，p53也受到上游蛋白p38MAPK的調(diào)控，后者參與了調(diào)控細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M細(xì)胞周期阻滯[23]。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文采用Western blot技術(shù)對(duì)p53蛋白及其上游蛋白MDM2和p38MAPK的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。相比空白對(duì)照組，乙醇處理后能顯著上調(diào)p-p53和p-p38MAPK的蛋白表達(dá)量，同時(shí)顯著下調(diào)p-MDM2蛋白的表達(dá)量，表明乙醇作用于LO2細(xì)胞后啟動(dòng)了p53信號(hào)通路及其上游的相關(guān)蛋白，繼而引發(fā)細(xì)胞發(fā)生G2/M阻滯。而經(jīng)不同濃度的CUR/CDP處理后，能夠下調(diào)乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的p-p53和p-p38MAPK蛋白表達(dá)量，分別從乙醇處理組的(100.00±1.50)%和(100.00±1.50)%下降到(92.56±4.37)%、(78.38±8.23)%、(63.07±5.73)%、(48.76±2.63)%和(89.67±3.06)%、(82.72±5.54)%、(69.26±4.71)%、(62.99±3.08)%，呈現(xiàn)出明顯地劑量效應(yīng)。上述結(jié)果表明，CUR/CDP通過(guò)減輕DNA損傷導(dǎo)致其下游蛋白p-p53和p-p38MAPK的表達(dá)水平下調(diào)抑制乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生的G2/M阻滯。

a-不同處理組的p-p38MAPK、p-MDM2、p53和p-p53蛋白條帶;b-不同處理組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平; c-不同處理組的p-MDM2蛋白表達(dá)水平;d-不同處理組的p-53蛋白表達(dá)水平;e-不同處理組的p-p53蛋白表達(dá)水平圖5 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)p53、p-p53、p-p38MAPK和p-MDM2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of CUR/CDP pretreatment on the expression levels of p53, p-p53, p-p38MAPK and p-MDM2 proteins

2.5 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)ROS熒光強(qiáng)度變化的影響

研究表明，當(dāng)肝臟受到過(guò)量乙醇刺激時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)ROS含量會(huì)顯著增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生損傷[24]。同時(shí)，ROS也能促進(jìn)p38MAPK的活化從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期細(xì)胞周期阻滯[25]。為了驗(yàn)證上述結(jié)論，本研究通過(guò)檢測(cè)DCFH-DA在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。當(dāng)細(xì)胞內(nèi) ROS含量增多時(shí)，DCFH-DA的綠色熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)，當(dāng)LO2細(xì)胞內(nèi)ROS含量減少時(shí)，DCFH-DA的綠色熒光強(qiáng)度會(huì)減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，乙醇處理組中細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA的綠色熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，表明乙醇處理細(xì)胞后顯著提高了細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。經(jīng)10～80 μg/mL CUR/CDP處理后，LO2細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA的綠色熒光強(qiáng)度逐漸減弱，這表明CUR/CDP能夠顯著降低乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，并呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活性氧是乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M阻滯的源頭，而姜黃素超分子包合物通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量來(lái)改善乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

圖6 CUR/CDP預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)的ROS熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effects of CUR/CDP pretreatment on ROS fluorescence intensity induced by ethanol

2.6 CUR/CDP預(yù)處理改善乙醇誘導(dǎo)肝損傷可能涉及的信號(hào)通路

基于上述研究結(jié)果，本文構(gòu)建了CUR/CDP改善乙醇誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞損傷涉及的信號(hào)通路圖，如圖7所示，乙醇作用LO2肝細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量急劇增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷從而引起γ-H2AX、p-ATM蛋白水平的上調(diào)和p-MDM2蛋白水平的下調(diào)。同時(shí)ROS含量的增加也上調(diào)了p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平。兩者的共同作用促進(jìn)了下游蛋白p53的磷酸化，活化后的p53蛋白能夠上調(diào)p21蛋白的表達(dá)量。后者通過(guò)下調(diào)cyclin B1蛋白的表達(dá)從而抑制cyclin B1-CDK復(fù)合物的活性導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G2/M細(xì)胞周期阻滯。而經(jīng)CUR/CDP處理后，CUR/CDP從源頭上降低了細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，從而減弱了DNA的損傷，避免了DNA下游相關(guān)蛋白變化引發(fā)的G2/M期細(xì)胞阻滯，最終改善了乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

圖7 CUR/CDP改善乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷涉及的信號(hào)通路圖Fig.7 Signaling pathways involved in CUR/CDP improving injury of LO2 cells induced by ethanol

3 結(jié)論

本文通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和檢測(cè)LO2肝細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度考察CUR/CDP改善乙醇誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CUR/CDP能夠通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)G2/M期的細(xì)胞數(shù)量抑制乙醇誘導(dǎo)的G2/M期阻滯。進(jìn)一步對(duì)其相關(guān)蛋白和細(xì)胞內(nèi)ROS含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CUR/CDP通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量減輕DNA損傷引發(fā)其下游蛋白p-ATM、γ-H2AX、p-p53和p-p38MAPK表達(dá)水平的下調(diào)抑制乙醇誘導(dǎo)的G2/M期阻滯，最終避免細(xì)胞出現(xiàn)肝損傷。上述結(jié)果證實(shí)，CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，為其今后的臨床應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。