姚家鈺，曹可軒，鄒云帆，單媛媛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌，712100)

隨著人們對可持續(xù)型和環(huán)境友好型產(chǎn)品的廣泛關(guān)注，利用天然生物大分子構(gòu)建活性成分的遞送體系愈發(fā)受到重視。其中，蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合載體因其高生物相容性、可生物降解性及無毒性，逐漸成為用于構(gòu)建膠體粒子的最常見食品級生物聚合物[1]。例如，利用反溶劑法制備具有核殼結(jié)構(gòu)的玉米醇溶蛋白/阿拉伯膠運(yùn)載體系，可以實(shí)現(xiàn)對生育酚的高效負(fù)載且具備良好的酸堿穩(wěn)定性[2]；大豆分離蛋白與大豆多糖可通過自組裝制備單分散納米顆粒并與姜黃素結(jié)合形成微膠囊結(jié)構(gòu)[3]；乳清蛋白、酪蛋白可以同帶有相反電荷的多糖以靜電力相結(jié)合，而后通過疏水作用和靜態(tài)猝滅與花色苷發(fā)生相互作用，增強(qiáng)花色苷的穩(wěn)定性[4]。但目前關(guān)于蛋白/多糖相互作用的研究主要聚焦在單一的蛋白和多糖，而對以蛋清蛋白為代表的復(fù)雜蛋白體系與多糖相互作用的研究較少。殼聚糖(chitosan， CS)是自然界中為數(shù)不多的堿性食品級陰離子多糖，具有良好的抗氧化性、成膜性和抑菌性[5]。諸多研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)與多糖間的相互作用力主要是靜電力，此種作用力高度依賴生物高分子的自身特性，如總濃度，混合比例，側(cè)鏈基團(tuán)種類，同時還受環(huán)境條件如pH和溫度的影響[6]。此外，熱處理可加速多糖/蛋白體系相變的發(fā)生，適當(dāng)加熱可制備微凝膠[7]，此種微凝膠與蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合物在理化性質(zhì)上是否存在差異尚缺少充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究以蛋清蛋白(egg white protein， EW)與CS為原料，利用簡單的靜電相互作用制備EW/CS復(fù)合物，并將其加熱得到EW/CS微凝膠。從濁度、粒徑、Zeta電位、紫外光譜及流變學(xué)角度分析微凝膠與復(fù)合物性質(zhì)上的差異，并進(jìn)一步探究兩者用于花青素(anthocyanin， AN)的穩(wěn)態(tài)維持與遞送的可行性[8]，以期為構(gòu)建特定的膠體遞送體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋清蛋白粉末，使用新鮮蛋清進(jìn)行冷凍干燥制備，由95%的蛋白質(zhì)組成，脂肪含量以干重計小于1%；殼聚糖(脫乙酰度為75%)，北京索萊寶科技有限公司；藍(lán)莓花青素提取物，密蘇里州圣路易斯公司(中國)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1900 紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；DHR1型流變儀，美國TA公司；ZS90型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 EW/CS復(fù)合物與微凝膠的制備

稱取殼聚糖粉和蛋清粉，于室溫下分別溶解于0.8%(體積分?jǐn)?shù))醋酸溶液和0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液，磁力攪拌使之完全溶解以制備成2 mg/mL溶液。將EW溶液按照不同比例緩慢滴入CS溶液中，同時以純蛋清和CS為對照。通過加入0.1 mol/L的醋酸或0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)體系至不同pH值，室溫下攪拌30 min以制得復(fù)合物。將制備的復(fù)合物于60 ℃加熱30 min得到微凝膠。

1.3.2 聚合物質(zhì)量比對EW/CS體系性質(zhì)的影響

在pH為6.0，EW質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的條件下，分別按照EW與CS質(zhì)量比=10∶2、10∶4、10∶6、10∶8和10∶10制備EW/CS復(fù)合物和微凝膠，進(jìn)行濁度、粒徑、Zeta電位、紫外吸收光譜及流變學(xué)性質(zhì)的測定。

1.3.3 pH值對EW/CS體系性質(zhì)的影響

設(shè)置EW質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，EW與CS質(zhì)量比=10∶8，通過添加0.1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)整復(fù)合體系pH值=2、3、4、5、6、7，制備EW/CS復(fù)合物和微凝膠，進(jìn)行粒徑、Zeta電位、紫外吸收光譜及流變學(xué)性質(zhì)的測定。

1.3.4 AN提取物含量對EW/CS體系性質(zhì)的影響

設(shè)置EW質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，EW與CS質(zhì)量比=10∶8，pH 6.0，添加1%、3%、5%、7%、9%和12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的藍(lán)莓AN提取物，制備EW/CS/AN復(fù)合物和微凝膠，進(jìn)行理化性質(zhì)的測定。

1.3.5 濁度、粒徑和Zeta電位分析

使用UV-分光光度計，以蒸餾水為空白對照，于600 nm，25 ℃條件下測量樣品濁度。使用激光粒度儀，以相同濃度的CS溶液和EW溶液作為對照，在25 ℃測量樣品的粒徑和Zeta電位。

1.3.6 紫外吸收光譜掃描

使用分光光度計，測試溫度25 ℃，掃描范圍220～500 nm，測量不同樣品的UV-Vis吸收光譜。同時以1.0 mg/mL的CS溶液和EW溶液作為對照。

1.3.7 流變學(xué)性質(zhì)的測定

使用流變儀在室溫(25 ℃)下測定不同樣品的表觀黏度和動態(tài)黏彈性質(zhì)，測試夾具CP4/40，間距1.0 mm，錐角4°，平衡5 min，應(yīng)力0.1 Pa，應(yīng)力剪切范圍1～100 s-1[9]。

1.3.8 AN負(fù)載量的測定

稱取CS粉和花青素，于室溫下溶解于0.8%醋酸溶液，磁力攪拌使之完全溶解以制備成CS 1.6 mg/mL、AN 0.5 mg/mL的溶液。與等量2 mg/mL EW溶液混合并調(diào)節(jié)體系pH=6，分別制備復(fù)合物與微凝膠。負(fù)載率的計算方法參照文獻(xiàn)[10]并加以改動：分別精密吸取5 mL的微粒溶液至于Ultra-15超濾離心管中(截留分子質(zhì)量10 000)，于4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，游離AN分離至外部離心管，在530 nm處用紫外分光光度計測定其吸光值，通過制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未負(fù)載AN含量，按公式(1)計算負(fù)載率：

(1)

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 2017和Excel 2017分析所有數(shù)據(jù)。通過單向方差分析(ANOVA)對樣本進(jìn)行比較，并通過SPSS軟件使用Duncan檢驗(yàn)分析顯著差異。所有數(shù)據(jù)重復(fù)測量3次并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物質(zhì)量比的影響

2.1.1 濁度、Zeta電位和粒徑

生物高分子間的相互作用可以用濁度進(jìn)行簡單表征。濁度主要由溶液中聚合物分子質(zhì)量和大小的變化引起，因此濁度的變化被認(rèn)為是蛋白質(zhì)-多糖聚合物形成或解離的結(jié)果[11]。一般情況下，膠體乳液的濁度受溶液中顆粒的濃度、折射率以及粒徑影響，而這些指標(biāo)在溶液中形成復(fù)合物或微凝膠的過程中都會發(fā)生改變。因此，本研究結(jié)合濁度、粒徑和Zeta電位的測量結(jié)果來表征EW與CS間發(fā)生的相互作用，結(jié)果如圖1所示。

如圖1-a，純CS溶液(0∶10)在pH 6.0時不含有大的懸浮顆粒，吸光度接近于0。在EW濃度固定的條件下，隨著混合體系中CS的濃度增大，復(fù)合物與微凝膠體系的濁度均下降，ZHANG等[6]研究中豌豆分離蛋白/殼聚糖復(fù)合物水溶液濁度隨著CS濃度的升高而下降的趨勢一致。由圖1-b中也可以看出，CS的添加使復(fù)合物與微凝膠的粒徑均降低，這可能是由于CS濃度的增加，體系中與單位蛋白結(jié)合的殼聚糖分子增加，改變了蛋白原有的伸展結(jié)構(gòu)，使其折射率下降、光散射減少，從而引起濁度和粒徑的降低[12]。

CS是一種堿性多糖，在廣泛的pH的范圍內(nèi)都帶有正電荷。蛋清中大部分蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在4.5～6.0，在低pH條件下蛋清溶液帶負(fù)電荷。EW/CS體系相比于EW(10∶0)溶液具有更高的正電荷，但相對于CS溶液(0∶10)電性較弱(圖1-c)，說明EW和CS在一定pH范圍內(nèi)發(fā)生了電荷中和，可以推測它們之間很有可能形成靜電復(fù)合物[13]。

a-濁度；b-粒徑；c-電位圖1 EW與CS質(zhì)量比對復(fù)合物與微凝膠濁度、粒徑和Zeta電位的影響(P<0.05)Fig.1 Effect of mass ratio of EW to CS on turbidity, particle size and Zeta potential of complexes and microgels(P<0.05) 注：大寫字母不同表示相同原料比例下兩處理組樣品結(jié)果差異顯著；小寫字母不同表示同處理組樣品在不同原料比例下結(jié)果差異顯著(下同)

2.1.2 紫外吸收光譜

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CS的結(jié)合對EW微觀構(gòu)象的影響，對不同比例的復(fù)合物與微凝膠進(jìn)行了紫外吸收光譜掃描。構(gòu)成蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸殘基具有紫外吸收性質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子所處的微環(huán)境發(fā)生改變，會引起氨基酸殘基構(gòu)象變化，進(jìn)而使基團(tuán)的紫外吸收光譜發(fā)生變化[14]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與多糖相互作用后會引起吸收峰的位移和吸光度的改變，這些變化于280 nm附近對環(huán)境變化高度敏感[15]，故可利用UV光譜曲線反映EW與CS的相互作用結(jié)果。如圖2所示，CS溶液在280 nm處無紫外吸收，復(fù)合物與微凝膠在280 nm處的吸收峰強(qiáng)度高于相同濃度的EW溶液，說明CS與EW蛋白間發(fā)生了相互作用，這種相互作用導(dǎo)致EW結(jié)構(gòu)骨架趨于松散，肽鏈的伸展使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水區(qū)中芳香族氨基酸殘基裸露。吸收峰強(qiáng)度的增強(qiáng)也表明此種構(gòu)象的變化有利于蛋白質(zhì)分子中色氨酸和酪氨酸殘基芳香環(huán)的π-π*躍遷[14]。隨著CS添加量的增加，復(fù)合物在280 nm處的吸收峰值下降，這可能是由于長碳鏈殼聚糖的空間屏蔽作用使蛋白質(zhì)與多糖的結(jié)合更為緊密，減少了蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的暴露[6]。微凝膠在280 nm處的吸收峰值均高于對應(yīng)的復(fù)合物，這可能與熱處理導(dǎo)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。

a-復(fù)合物；b-微凝膠圖2 EW與CS質(zhì)量比對復(fù)合物與微凝膠紫外吸收的影響Fig.2 Effect of mass ratio of EW to CS on UV absorption of complexes and microgels

2.1.3 流變學(xué)性質(zhì)

黏彈性質(zhì)是反映高分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的重要指標(biāo)。先前的研究結(jié)果表明，復(fù)合物黏度與對小分子藥物的包埋率存在正相關(guān)性[16]，因而分析復(fù)合物與微凝膠的黏度可在一定程度上反應(yīng)其功能性質(zhì)。EW/CS不同體系黏度變化如圖3所示。復(fù)合物和微凝膠黏度均隨剪切速率增加而降低，表明二者為假塑性流體[17]，在剪切速率增加的過程中，分子按照剪切的方向呈現(xiàn)線性排列。在復(fù)合物中(圖3-a)，CS的添加明顯提高了蛋清溶液的黏度，說明CS與EW發(fā)生相互的作用改變了體系的物理特性。在微凝膠體系中，純EW溶液黏度的明顯增加，可能是由于蛋白在變性溫度附近長時間加熱導(dǎo)致部分凝集造成的(圖3-b)。低濃度CS的添加并沒有顯著影響蛋清蛋白的黏度，但當(dāng)EW與CS的質(zhì)量比達(dá)到1∶1后，微凝膠體系的黏度反而下降，這可能是由于蛋白可以通過物理相互作用與多糖結(jié)合，導(dǎo)致體系電荷被中和，分子鏈的運(yùn)動和擴(kuò)散更容易進(jìn)行，體系更容易達(dá)到能量較低的穩(wěn)定狀態(tài)[18]，這可以進(jìn)一步通過動態(tài)掃描獲得相應(yīng)的黏彈性參數(shù)來進(jìn)行驗(yàn)證。圖3-c、圖3-d顯示了不同的EW/CS體系中儲能模量(G′)隨時間的變化情況。EW和CS發(fā)生相互作用時G′值會迅速增加，凝膠點(diǎn)是體系G′為1 Pa時的參數(shù)點(diǎn)，是多糖/蛋白體系相轉(zhuǎn)變的重要參數(shù)[19]。由圖3可以看出，CS的添加縮短了EW形成可溶性復(fù)合物及凝膠網(wǎng)格的時間，但是當(dāng)復(fù)合物中EW∶CS超過10∶4后(微凝膠10∶6)，CS的添加使得體系中未被中和的電荷量增加，體系能量較高難以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，EW/CS凝膠網(wǎng)格形成延緩。

a-復(fù)合物黏度；b-微凝膠黏度；c-復(fù)合物儲能模量；d-微凝膠儲能模量圖3 EW/CS質(zhì)量比對復(fù)合物與微凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響Fig.3 Effect of mass ratio of EW to CS on the rheological properties of complexes and microgels

2.2 環(huán)境pH的影響

2.2.1 粒徑和Zeta電位

pH值會影響靜電相互作用的大小與范圍，進(jìn)而對通過此種相互作用結(jié)合的蛋白/多糖性質(zhì)造成改變[20]。如前所述，EW和CS在一定pH范圍內(nèi)會發(fā)生電荷中和，實(shí)驗(yàn)pH范圍內(nèi)(pH 2.0～6.0)就有此種中和反應(yīng)發(fā)生，復(fù)合物與微凝膠2種體系在此范圍內(nèi)都較為穩(wěn)定，但復(fù)合物體系比微凝膠體系的Zeta電位具有更高的pH穩(wěn)定性(圖4-a)。此外，在pH變化過程中微凝膠平均粒徑均高于復(fù)合物(圖4-b)。以上結(jié)果表明，對復(fù)合物進(jìn)行熱處理會引起其微觀結(jié)構(gòu)的改變和電位特性的變化，這些變化將會影響其穩(wěn)定性。

a-電位；b-粒徑圖4 環(huán)境pH對復(fù)合物與微凝膠Zeta電位和粒徑的影響 (P<0.05)Fig.4 Effect of environmental pH on the Zeta potential and particle size of complexes and microgels(P<0.05)

2.2.2 紫外吸收光譜

如圖5-a，單一EW溶液于pH 5時紫外吸收峰達(dá)最大值，在此等電點(diǎn)附近的環(huán)境pH條件下，蛋白分子間發(fā)生凝集導(dǎo)致吸光度增加。CS的加入改變了其原有的電荷性質(zhì)，使EW溶液于280 nm處的吸收峰降低。pH 4條件下EW溶液與EW/CS混合溶液吸光度峰值基本相同，說明較低的pH值更有利于復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。如圖5-b，微凝膠中紫外吸收光譜整體變化趨勢與復(fù)合物近似，隨著環(huán)境pH改變，EW/CS微凝膠峰值波動較大，表明微凝膠隨環(huán)境pH變化結(jié)構(gòu)改變更為明顯，有望用于酸堿觸發(fā)釋放載體的構(gòu)建。而復(fù)合物相對穩(wěn)定，可適用于持續(xù)釋放載體的構(gòu)建。

2.2.3 流變學(xué)性質(zhì)

EW與CS在酸性水溶液中均帶電荷，具有聚電解質(zhì)特性，因而環(huán)境pH對其溶液性質(zhì)存在一定影響。如圖6-a，EW/CS復(fù)合物黏度隨pH增大而上升，并于pH 6時達(dá)到最大值，微凝膠中pH-黏度整體變化趨勢與復(fù)合物基本一致，但黏度曲線隨環(huán)境pH變化更顯著，進(jìn)一步表明EW/CS微凝膠對環(huán)境pH的改變更為敏感。

2.3 AN提取物含量

AN具有多種生理活性，但其自身性質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[21]。本研究對EW與CS質(zhì)量比為10∶8，環(huán)境pH為6，AN提取物添加量為8%時，EW/CS復(fù)合物與微凝膠對花青素的負(fù)載率進(jìn)行計算。結(jié)果如圖7所示，EW/CS復(fù)合物與微凝膠均可實(shí)現(xiàn)對AN的有效負(fù)載，負(fù)載率分別為55.31%和50.61%，這可能是由于復(fù)合物在加熱形成微凝膠的過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響了對AN的負(fù)載。因此，本研究進(jìn)一步考察了AN添加量對EW/CS復(fù)合體系結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的影響，如圖8和圖9所示。

a-復(fù)合物；b-微凝膠圖5 環(huán)境pH對復(fù)合物與微凝膠紫外吸收光譜的影響Fig.5 Effect of environmental pH on the viscosity of complexes and microgels

a-復(fù)合物黏度；b-微凝膠黏度；c-復(fù)合物儲能模量；d-微凝膠儲能模量圖6 環(huán)境pH對復(fù)合物與微凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響Fig.6 Effect of environmental pH on the rheological properties of complexes and microgels

2.3.1 濁度、粒徑和Zeta電位

AN在水溶液中溶解呈弱酸性，帶負(fù)電，其添加會影響蛋白/多糖體系的特性[22]。如圖8所示，當(dāng)AN添加量低于3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，復(fù)合物與微凝膠體系濁度、粒徑降低，Zeta電位升高。當(dāng)AN添加量超過3%，復(fù)合物與微凝膠體系濁度、粒徑升高，Zeta電位降低，電荷平衡狀態(tài)難以維系，溶質(zhì)部分析出，體系穩(wěn)定狀態(tài)被破壞。微凝膠體系的粒徑在AN添加量為1%～5%時低于復(fù)合物(圖8-a)。綜上所述，在AN添加量為3%時體系較為穩(wěn)定。

2.3.2 流變學(xué)性質(zhì)

AN可以與多糖產(chǎn)生氫鍵相互作用而影響體系的流變學(xué)性質(zhì)[23]。如圖9所示，EW/CS復(fù)合物和微凝膠體系中，AN添加量對復(fù)合物體系黏度的影響不大，但加入AN后EW/CS微凝膠黏度明顯高于復(fù)合物(圖9-a，圖9-b)。同時，微凝膠的凝膠網(wǎng)格形成時間明顯延長(圖9-c，圖9-d)，這是由于AN自身帶有的電荷影響了體系原有的靜電相互作用[22]，這種相互作用的改變破壞了EW/CS間結(jié)合的穩(wěn)定性，進(jìn)而也對體系的熱穩(wěn)定性造成影響。

圖7 復(fù)合物與微凝膠對花青素的負(fù)載(P<0.05)Fig.7 Complexation of anthocyanin by complexes and microgels (P<0.05)

3 結(jié)論

利用簡單的靜電相互作用驅(qū)動方法可以制備EW/CS復(fù)合物，對復(fù)合物加熱可得微凝膠，2種體系均可用于AN的負(fù)載與遞送。EW與CS的質(zhì)量比對

a-粒徑；b-電位；c-濁度圖8 花青素添加量對復(fù)合物與微凝膠粒徑、Zeta電位和濁度的影響(P<0.05)Fig.8 Effect of anthocyanin addition on particle size, Zeta potential and turbidity of complexes and microgels(P<0.05)

a-復(fù)合物黏度；b-微凝膠黏度；c-復(fù)合物儲能模量；d-微凝膠儲能模量圖9 花青素添加量對復(fù)合物與微凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響Fig.9 Effect of anthocyanin addition on the rheological properties of complexes and microgels

復(fù)合物和微凝膠的粒徑及電荷性質(zhì)有顯著影響。通過改變pH和AN的添加量，可以調(diào)節(jié)EW與CS間的靜電相互作用，從而可對形成的復(fù)合物及微凝膠的性質(zhì)進(jìn)行調(diào)控。2種體系相比，EW/CS的微凝膠對環(huán)境變化更為敏感，適用于酸堿觸發(fā)釋放載體的構(gòu)建，而復(fù)合物性質(zhì)相對穩(wěn)定，適用于持續(xù)釋放載體的構(gòu)建。