肖婭楠，周學(xué)飛

(昆明理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

木素是自然界中最豐富的天然酚類聚合物，其來源豐富且可再生.眾多的官能團(tuán)和獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，賦予了木素抗氧化性、抗癌變、抗誘變等生物活性，是一種天然的抗氧化劑[1]，而且工業(yè)木素成本低廉，屬于綠色化工原料，能夠利用其制備多種高附加值的化學(xué)品.近年來，科學(xué)工作者在降解木素方面作了不少努力，木素降解主要是通過弱化和斷裂木素結(jié)構(gòu)中的化學(xué)鍵，或使其產(chǎn)生一些易于反應(yīng)的基團(tuán)或活性位點(diǎn)，來提高木素的反應(yīng)活性，從而實(shí)現(xiàn)木素降解[2].目前，木素的降解方法主要有熱解、氫解、生物酶降解等方法.其中，生物酶降解因其專一性強(qiáng)和環(huán)境友好具有很好的發(fā)展前景[3].漆酶是生物酶的一種，它從酚羥基取代一個(gè)電子催化底物中的酚型結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使木素聚合或降解.然而，漆酶的實(shí)際應(yīng)用受限于其穩(wěn)定性低、利用率低、成本高等缺點(diǎn).為了增加漆酶的可用性，研究者將漆酶固載于載體上，既克服了游離酶的缺點(diǎn)，又保持了酶的活性，同時(shí)還呈現(xiàn)出易分離、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)[4].Liu等[5]以碳球?yàn)檩d體固定漆酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定化漆酶活性高達(dá)91%，對酚類化合物的降解效率可達(dá)84%.金屬(salen)配合物的活性中心與生物酶相似且易合成、選擇性好，因此其在木素降解領(lǐng)域有著很大的應(yīng)用前景[6], Badamali等[7]將 Co(salen)配合物固定在硅質(zhì)SBA-15上，在微波加熱條件下,可以選擇性地將型木素模型化合物二聚體降解為2-甲氧基苯酚.

木素本身含有的羥基，使其具有一定的抗氧化性能，能夠應(yīng)用到抗氧化劑等多種領(lǐng)域.但木素大分子復(fù)雜的結(jié)構(gòu)限制了其應(yīng)用前景，且催化劑的單獨(dú)使用難以使木素大分子得到高效碎解[8]，本文采用固定化Co(salen)和固定化漆酶協(xié)同催化降解硫酸鹽木素，以增強(qiáng)其抗氧化性能，為實(shí)現(xiàn)其綠色、高效發(fā)展奠定理論基礎(chǔ).

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

硫酸鹽木素由所在課題組提供.游離漆酶酶活為277.8 U/g.采用沉積法將Co(salen)和漆酶固定在氧化石墨烯上[9]，利用ICP-OES測定固定化Co(selen)中Co含量，結(jié)果為10.6 mg/L.用ABTS方法測得固定后漆酶活性為24.7 U/g載體[10].

1.2 催化處理硫酸鹽木素

分別以固定化Co(salen)、固定化漆酶和固定化Co(salen)/固定化漆酶為催化劑，30%H2O2為氧化劑進(jìn)行硫酸鹽木素催化實(shí)驗(yàn).

第一步，比較單個(gè)催化劑催化與一鍋法的效果.(1)過氧化氫+固定化Co(salen)+木素.反應(yīng)時(shí)間1、2、3 h.溫度為室溫.H2O2用量3 mL，pH7(用pH值7的緩沖溶液作為反應(yīng)的溶液).硫酸鹽木素100 mg，100 mL緩沖液.固定化Co(salen)8 mg.(2)過氧化氫+固定化漆酶+木素.反應(yīng)時(shí)間1、2、3 h.溫度為室溫.H2O2用量3 mL，pH7(用pH值7的緩沖溶液作為反應(yīng)的溶液).硫酸鹽木素100 mg，100 mL緩沖液.固定化漆酶 8 mg.(3)過氧化氫+固定化Co(salen)/固定化漆酶+木素.反應(yīng)時(shí)間1、2、3 h.溫度為室溫.H2O2用量3 mL，pH 7(用pH值7的緩沖溶液作為反應(yīng)的溶液).硫酸鹽木素100 mg，100 mL緩沖液.固定化Co(salen)4 mg/固定化漆酶4 mg(固定化Co(salen)∶固定化漆酶=1∶1).

第二步，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化一鍋法的反應(yīng)條件.六因素五水平正交表：L25(56)正交表.因素A：時(shí)間，1、2、3、4、5 h.因素B：30% H2O2用量，1、2、3、4、5 mL.因素C：pH，5、6、7、8、9.因素D：催化劑總用量，6、7、8、9、10 mg.因素E：固定化Co(salen)/固定化漆酶比例，3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3.因素F：硫酸鹽木素用量，60、80、100、120、140 mg.

圖1 一鍋法催化與單個(gè)催化劑催化的比較Fig.1 Comparison of synergistic catalysis with single catalyst catalysis

第三步，以正交試驗(yàn)得到的反應(yīng)條件為基礎(chǔ)，采用單因素實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步優(yōu)化一鍋法催化反應(yīng)的條件.

1.3 紫外-分光光度計(jì)測定抗氧化性

吸光度測試條件：在波長557 nm處測定木素清除PTIO·時(shí)的吸光度.清除率按(1)式計(jì)算：

清除率=[(A0-A)/A0]×100%

(1)

式中：A0表示不加樣品時(shí)的吸光度，A表示加入樣品后的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 協(xié)同催化與單獨(dú)催化的效果比較

在課題組前幾屆畢業(yè)生研究的基礎(chǔ)上，本論文僅研究固定化漆酶、固定化Co(salen)、固定化Co(salen)/固定化漆酶三種催化方式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

從圖1中可以看出，協(xié)同催化劑的催化效果明顯好于單獨(dú)催化，說明兩種催化劑之間有較好的協(xié)同作用[11]，能夠破壞木素大分子的結(jié)構(gòu)單元，使更多的羥基暴露出來，從而使其清除自由基的能力增強(qiáng).

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化固定化Co(salen)/固定化漆酶協(xié)同催化木素

固定化Co(salen)/固定化漆酶催化硫酸鹽木素以增強(qiáng)其抗氧化性能的正交實(shí)驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果如表1所示.

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

從正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表中可知，不同因素對木素抗氧化性能的影響是不一樣的，影響程度依次為：C>D>B>F>A>E，以木素捕獲PTIO·自由基的能力為指標(biāo)，得出正交實(shí)驗(yàn)催化增強(qiáng)木素抗氧化性能的最有條件為：A3B3C1D1E5F5；即反應(yīng)時(shí)間為3 h，30%H2O2用量為3 mL，pH值為5，催化劑用量為6 mg，催化劑比例為1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量為140 mg.

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)具有布點(diǎn)均衡、整齊可比等特點(diǎn)，能夠在較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)中得到較優(yōu)的方案[12]，而且每個(gè)因素水平都出現(xiàn)相同的次數(shù)，能夠消除部分實(shí)驗(yàn)誤差帶來的干擾，但正交實(shí)驗(yàn)得出的優(yōu)選結(jié)果還是在所取水平的范圍之內(nèi)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的指向性不是十分明確.因此，為了有效解決正交實(shí)驗(yàn)局限性，以正交試驗(yàn)得到的反應(yīng)條件為基礎(chǔ)，采用單因素實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化協(xié)同催化反應(yīng)的條件，進(jìn)一步增強(qiáng)木素的抗氧化性能.

2.3.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間的影響Fig.2 The effect of reaction time

在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果盡可能好的前提下，縮短反應(yīng)時(shí)間，能節(jié)約生產(chǎn)成本，更符合綠色化學(xué)的發(fā)展要求.根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)時(shí)間的水平選取為：1～5，實(shí)驗(yàn)條件為：H2O2用量為3 mL，pH 為5，催化劑用量為6 mg，催化劑比例為1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量為140 mg.緩沖溶液100 mL.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，反應(yīng)時(shí)間從1 h到2 h過程中，木素清除自由基能力逐漸增強(qiáng)，在2 h時(shí)即可達(dá)27.05%的清除率，與兩種催化劑單獨(dú)使用相比，兩種催化劑協(xié)同使用能夠縮短反應(yīng)時(shí)間.在2 h到4 h之間自由基清除率大幅下降，這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的增長，催化劑結(jié)構(gòu)被破壞而使其失活，導(dǎo)致硫酸鹽木素的自由基清除率隨著下降.

2.3.2 H2O2用量的影響

圖3 H2O2用量的影響Fig.3 The effect of H2O2 dosage

H2O2在反應(yīng)過程中產(chǎn)生親核性極強(qiáng)的過氧化氫負(fù)離子HOO-作用于木素大分子[13]，使木素側(cè)鏈碎解，產(chǎn)生更多的羥基，使其自由基清除率增加.此外，H2O2還能與反應(yīng)中的Co(salen)發(fā)生作用，形成超氧配合物，進(jìn)一步作用于木素，使木素碎解[14].實(shí)驗(yàn)條件為：pH值為5，催化劑用量為6 mg，催化劑比例為1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量為140 mg，反應(yīng)時(shí)間2 h，緩沖液100 mL.如圖3所示，30%H2O2用量從2 mL到4 mL，木素的自由基清除能力逐漸增加，這說明增加H2O2的用量，對增強(qiáng)木素的抗氧化性能是有利的.但當(dāng)H2O2用量超過4 mL時(shí)，木素的自由基清除率基本不變，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加H2O2用量，木素結(jié)構(gòu)不再發(fā)生變化[15]，進(jìn)而自由基清除率也不會(huì)發(fā)生變化，從經(jīng)濟(jì)成本角度看，H2O2用量選擇3 mL為宜.

2.3.3 pH值的影響

圖4 pH值的影響Fig.4 The effect of pH

pH值是影響催化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)重要因素，因此對其進(jìn)行探究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，體系pH值從5增加到8時(shí)，木素自由基清除率明顯增加，但當(dāng)pH值超過8時(shí)，自由基清除率大幅下降，這是因?yàn)轶w系中pH值增加有利于H2O2異裂分解產(chǎn)生HOO-,加快木素大分子結(jié)構(gòu)碎解，進(jìn)而增加其自由基清除率，而當(dāng)體系中pH值超過8，會(huì)造成HOO-的無效分解，失去氧化作用;另一方面，pH值過大，會(huì)超過漆酶和Co(salen)的最適pH值，從而影響催化劑的活性，導(dǎo)致木素降解效果變差[16]，削弱了清除木素自由基的能力.因此pH值選擇8最合適.

2.3.4 催化劑總用量的影響

圖5 催化劑總用量的影響Fig.5 The effect of total amount of catalyst

實(shí)驗(yàn)條件為：pH值8，催化劑比例為1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量為140 mg，反應(yīng)時(shí)間2 h，30% H2O2用量4 mL，緩沖液100 mL.從圖5中我們可以看出，隨著催化劑用量的增加，木素自由基清除率整體呈先增加后降低的趨勢，在催化劑添加量為0時(shí)，木素自由基清除率僅為22.08%，當(dāng)催化劑用量增加到6 mg時(shí)，清除率可達(dá)64.71%，這表明在反應(yīng)體系中加入固定化Co(salen)和固定化漆酶能使木素捕獲自由基的能力顯著提升.然而當(dāng)催化劑總用量超過6 mg時(shí)，清除率呈現(xiàn)下降趨勢，此時(shí)H2O2被體系中過量的催化劑無效分解，木素碎解效率被削弱[17].因此催化劑總用量最佳選擇為6 mg.

圖6 催化劑比例的影響Fig.6 The effect of catalyst ratio

2.3.5 催化劑比例的影響

在協(xié)同催化反應(yīng)中，催化劑比例在很大程度上影響著反應(yīng)速率和木素的碎解效果[18].實(shí)驗(yàn)條件為：pH值8，催化劑總用量6 mg，木素用量為140 mg，反應(yīng)時(shí)間2 h，30% H2O2用量 4 mL，緩沖液100 mL.

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)固定化Co(salen)的用量多于固定化漆酶時(shí)，即漆酶用量少時(shí)，催化反應(yīng)的專一性變差，對木素醚鍵降解的專一性減少，酚羥基減少，木素自由基清除率下降[19].當(dāng)固定化漆酶用量多于固定化Co(salen)時(shí)，催化反應(yīng)的專一性增強(qiáng)，對木素醚鍵降解的專一性增強(qiáng)，酚羥基增加，清除率提高.固定化Co(salen)∶固定化漆酶選擇1∶3最佳.

2.3.6 木素用量的影響

圖7 木素用量的影響Fig.7 The effect of lignin dosage

實(shí)驗(yàn)條件為：pH值8，催化劑總用量6 mg，催化劑比例為1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，反應(yīng)時(shí)間2 h，30% H2O2用量4 mL，緩沖液100 mL.如圖7所示，木素用量對清除木素自由基能力的影響大體呈先增大后減小的趨勢，這是由于木素用量少時(shí)，產(chǎn)生的羥基少，從而自由基清除率就低，隨著木素的增加，催化劑和木素充分反應(yīng)，木素大分子結(jié)構(gòu)上的羥基被釋放出來，捕獲自由基能力相應(yīng)增強(qiáng)，但當(dāng)木素用量過多時(shí)，單位木素量的催化劑用量變少，催化效果減弱，木素醚鍵斷裂減弱，酚羥基變少，捕獲自由基能力下降.

3 結(jié) 論

通過對固定化Co(salen)/固定化漆酶協(xié)同催化增強(qiáng)木素抗氧化性能工藝條件的初步探究，得出以下結(jié)論：

1) 固定化Co(salen)與固定化漆酶協(xié)同催化對增強(qiáng)其抗氧化性能的效果明顯優(yōu)于單一催化劑；

2) 固定化Co(salen)與固定化漆酶協(xié)同催化對增強(qiáng)其抗氧化性能的最佳工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間2 h，H2O2用量4 mL，pH值8，催化劑總用量6 mg，催化劑比例1∶3，木素用量140 mg；

3) 在最佳條件下，固定化Co(salen)/固定化漆酶協(xié)同催化，可使木素的自由基清除率達(dá)到64.71%.