汪居安，宋雪敏，王俐晴，王亞奇，謝露紅，汪 煒，王健君

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002)

“丁香莫與郁金見”是“十九畏”之一，最早來源于《醫(yī)經(jīng)小學(xué)》[1]，是中藥配伍禁忌的主要內(nèi)容之一?！吨腥A人民共和國藥典(2015年版)》也記載“丁香不宜與郁金同用”[2]。然而丁香同方配伍郁金自古有之，如《春腳集》所載“十香返魂丹”用于治療痰厥中風(fēng)昏迷[3]，現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)重疊社團(tuán)[4]發(fā)現(xiàn)，兩藥配伍還可應(yīng)用于呃逆、胸痹(冠心病)等病的治療。長期以來，“十九畏”同方配伍的禁忌爭議不斷，且缺乏足夠的理論支持與科學(xué)驗(yàn)證結(jié)果[5]。

肝纖維化是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)過度異常增生的病理過程，是多種慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)[6-7]。中藥郁金抗肝損傷、抗纖維化的確切作用已得到驗(yàn)證[8-10],本研究以丁香配伍郁金，探究丁香的存在對郁金緩解小鼠肝纖維化的影響，以期進(jìn)一步探索丁香郁金配伍的理論內(nèi)涵，豐富和發(fā)展中藥配伍禁忌內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級5周齡左右的健康雄性KM小鼠32只，體質(zhì)量(25±2)g,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證:SCXK(遼)2020-0001；實(shí)驗(yàn)動物使用許可證:SYXK(皖)2018-004,分籠飼養(yǎng),室溫25。C左右，自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2 主要藥品、試劑及器械 丁香粉、郁金粉(六安市丹貝爾生物科技有限公司)；CCl4(成都市科龍化工試劑廠，批號20130329)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測試盒、透明質(zhì)酸(HA)測試盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒(均購自南京建成生物工程研究所)。多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；數(shù)碼顯微鏡(北京京昊永成貿(mào)易有限公司)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 藥品配置 精確稱取郁金粉2 g，適量溫水溶解，文火煮沸2 h，蒸發(fā)濃縮至50 mL(相當(dāng)于生藥濃度400 mg/mL)；藥品總質(zhì)量不變，丁香與郁金粉按1∶1配置，重復(fù)如上操作。冷卻至室溫后，放入冰箱備用。CCl4與橄欖油按1∶9比例混合，配成10%的CCl4溶液，常溫避光保存。

1.4 動物分組與給藥方法 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)均分為4組。郁金組、丁郁組按2 mL/kg灌胃給藥，空白組、模型組給予等量的生理鹽水；灌胃同時(shí)，郁金組、丁郁組、模型組按2 mL/kg腹腔注射10%CCl4的橄欖油溶液，空白組腹腔注射等量橄欖油。每周3次，持續(xù)7周。

1.5 生化檢測 于末次給藥24 h后摘取眼球取血，7 500 r/min離心2 min，取血清用相應(yīng)測試盒檢測小鼠ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA含量。

1.6 動物標(biāo)本的制備 取血后脊椎脫臼處死小鼠，迅速剖腹取肝，取肝右葉浸泡于福爾馬林溶液固定24 h后，脫水、石蠟包埋、蘇木精伊紅(HE)染色制成組織切片，通過數(shù)碼顯微鏡檢查各組小鼠肝臟的組織結(jié)構(gòu)并攝像。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠ALT、AST活性比較 模型組、郁金組、丁郁組的血清ALT、AST水平均高于空白組(P<0.05)；郁金組、丁郁組的血清ALT、AST水平均低于模型組(P<0.05)；丁郁組血清AST水平低于郁金組(P<0.05)。其他詳見表1。

2.2 各組小鼠HA、IL-6、SOD、MDA水平比較 模型組的血清HA、IL-6、MDA水平均高于空白組(P<0.05)；郁金組、丁郁組的血清HA、IL-6、MDA水平均低于模型組而高于空白組(P<0.05)；郁金組、丁郁組的血清SOD水平均高于空白組和模型組(P<0.05)；丁郁組的血清HA、IL-6水平低于郁金組(P<0.05)。其他詳見表1。

表1 中藥對小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平的影響

2.3 肝組織病理切片觀察 空白組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無明顯變性壞死與炎細(xì)胞浸潤；模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，可見大量氣球樣變、壞死、明顯炎細(xì)胞浸潤與膠原纖維沉積；郁金組和丁郁組與模型組相比，細(xì)胞變性壞死、炎細(xì)胞浸潤與膠原纖維沉積的數(shù)量和范圍均有較大改善；郁金組和丁郁組兩者細(xì)胞變性壞死程度與范圍相近，但后者炎細(xì)胞浸潤與膠原沉積程度較輕。見圖1。

標(biāo)尺500 μm。A.模型組；B.空白組；C.郁金組；D.丁郁組。

3 討論

CCl4是一種強(qiáng)溶脂性的有機(jī)溶劑，進(jìn)入肝臟后經(jīng)肝細(xì)胞色素P450依賴性功能氧化酶的代謝，生成自由基CCl3-和CCl3O23-破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),使膜磷脂過氧化而生成脂質(zhì)過氧化物(lipid hydroperoxide,LPO),導(dǎo)使肝細(xì)胞損壞[13]。ALT和AST是胞內(nèi)酶，當(dāng)肝細(xì)胞損壞時(shí)會釋放入血，引起血清含量升高。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，其通過催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，從而防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，其活力的高低反映了機(jī)體清除自由基的能力；MDA是LPO的中間代謝產(chǎn)物之一，其水平可反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映細(xì)胞受自由基攻擊的程度[14]。

CCl4作用于肝星狀細(xì)胞使其激活和轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞迅速增殖發(fā)展為肝纖維化[15]。HA為膠原成分之一,可較準(zhǔn)確靈敏地反映肝內(nèi)已生成的纖維量，其水平與肝纖維化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。肝細(xì)胞變性壞死釋放多種炎癥因子,IL-6是最主要炎癥因子之一,可作用于肝臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原進(jìn)一步加重肝細(xì)胞損傷與纖維化[16]。

本研究結(jié)果顯示，模型組的血清HA、IL-6、MDA水平均高于空白組(P<0.05)，鏡檢顯示肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，可見大量氣球樣變、壞死、明顯炎細(xì)胞浸潤與膠原纖維沉積，說明本研究用CCl4成功造模肝纖維化小鼠，驗(yàn)證了CCl4通過自由基損傷與炎癥反應(yīng)兩方面導(dǎo)致肝纖維化的形成。模型組血清SOD水平與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能是由于細(xì)胞被大量破壞導(dǎo)致SOD生成減少以及SOD抗氧化時(shí)的大量消耗。

本研究結(jié)果也顯示，郁金組和丁郁組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較模型組清晰，細(xì)胞變性壞死、炎細(xì)胞浸潤與膠原纖維沉積的數(shù)量和范圍均有較大改善，且兩組血清HA水平均高于空白組(P<0.05)但低于模型組(P<0.05)，說明兩組小鼠均發(fā)生纖維化但程度較模型組輕；郁金組和丁郁組血清ALT、AST、IL-6、MDA水平均低于模型組(P<0.05)，SOD水平高于模型組(P<0.05)，說明郁金單用或合用丁香均能減輕CCl4對肝細(xì)胞的損傷與纖維化，減輕炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化能力。就兩組中藥而言，丁郁組血清AST輕度降低(P<0.05)，ALT、SOD、MDA水平與郁金組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明丁香、郁金兩藥合用對郁金抗肝損傷、抗氧化的作用無明顯影響或可能有增強(qiáng)作用，兩藥在該方面不屬“相畏”范疇；丁郁組血清HA、IL-6水平與郁金組相比降低(P<0.05)，說明兩藥配伍能夠增強(qiáng)郁金抗炎與抗纖維化的能力，提示兩藥在該方面屬“相使”范疇。值得注意的是，因兩藥合用能夠顯著減輕炎癥反應(yīng)，減輕膠原的沉積，我們推測，從長期來看，兩藥合用可能能夠進(jìn)一步延緩肝細(xì)胞變性壞死，從而表現(xiàn)出較郁金單用更強(qiáng)的抗肝損傷與氧化的作用。限于本研究時(shí)間較短，該推測需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，CCl4通過產(chǎn)生自由基和炎癥反應(yīng)兩方面造成肝纖維化；郁金單用或合用丁香均能夠通過增強(qiáng)抗氧化能力和減輕炎癥反應(yīng)干預(yù)肝纖維化；郁金合用丁香不影響郁金抗損傷、抗氧化能力，且能夠提高郁金抗炎、抗纖維化作用；兩藥配伍就治療肝纖維化而言不屬“相畏”或似屬“相使”范疇。

“十九畏”作為古代醫(yī)家智慧的結(jié)晶，至今仍指導(dǎo)著中藥臨床應(yīng)用。然而，“師古而不泥古”，當(dāng)今中醫(yī)藥工作者應(yīng)當(dāng)充分開展實(shí)驗(yàn)與臨床研究，取其精華，棄其糟粕，不斷補(bǔ)充和發(fā)展中藥配伍禁忌內(nèi)容，形成更科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹兴幣湮槔碚摚靡灾笇?dǎo)臨床應(yīng)用。