呂靜靜，程 浩，劉 虎，金孝岠，陳永權(quán)

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 麻醉科，安徽 蕪湖 241001)

七氟醚由于其誘導(dǎo)及蘇醒迅速、具有芳香氣味、對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響較小等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前臨床上最常使用的吸入麻醉藥之一，大量體外及在體實(shí)驗(yàn)研究表明其對(duì)發(fā)育中的大腦具有神經(jīng)毒性[1-2]，并引起長(zhǎng)期的學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)行為學(xué)異常[3]。發(fā)育大腦的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與七氟醚神經(jīng)毒性密切相關(guān)[4]。自噬是真核生物中進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞途徑，參與神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化和死亡，并與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[5]。適當(dāng)水平的自噬可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6]。有研究表明七氟醚激活神經(jīng)細(xì)胞自噬[7]，增加自噬可顯著抑制七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[8]，但七氟醚激活自噬的具體機(jī)制并不十分明確。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與自噬調(diào)控的主要負(fù)調(diào)控因子[9]，本研究擬探討七氟醚暴露對(duì)SHSY-5Y細(xì)胞自噬的影響及mTOR信號(hào)通路是否在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而為七氟醚發(fā)育神經(jīng)毒性提供可能的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SHSY-5Y細(xì)胞)(上海中科院細(xì)胞庫(kù))，雷帕霉素、lipofectamine2000、青霉素、鏈霉素、DMSO、β-actin一抗(Sigma公司，美國(guó))，LC3B、Atg5、p-mTOR、t-mTOR一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(Cell Signaling公司，美國(guó))，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))，共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，德國(guó))，F(xiàn)luorChem E化學(xué)發(fā)光高靈敏度凝膠成像與分析儀(Protein Simple公司，美國(guó))。

1.2 SHSY-5Y細(xì)胞培養(yǎng) 使用高糖DMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素，進(jìn)行SHSY-5Y細(xì)胞的培養(yǎng)，將鋪板的細(xì)胞置于95%空氣、5%CO2濕化的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每48 h更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞增長(zhǎng)至80%～90%匯合時(shí)進(jìn)行傳代或鋪板，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞于24 h后進(jìn)行藥物處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 取傳3或4代的細(xì)胞隨機(jī)分為4組(n=12)，空白對(duì)照組(C組)、空白對(duì)照+雷帕霉素50 nmol/L組(C+R組)、4.8%七氟醚12 h組(S組)和4.8%七氟醚12 h+雷帕霉素50 nmol/L組(S+R組)。于細(xì)胞鋪板24 h后，C+R組及S+R組加入雷帕霉素50 nmol/L，C組及S組加入等體積的溶劑DMSO，共培養(yǎng)1 h后將S組及S+R組置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)含4.8%七氟醚的密閉箱中處理12 h，C組及C+R組置入密閉箱外同一培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞鋪板24 h后，使用mRFP-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C組、C+R組、S組、S+R組12 h，12 h后C+R組及S+R組加入雷帕霉素50 nmol/L，C組及S組加入等體積的溶劑DMSO，共培養(yǎng)1 h后將S組及S+R組使用4.8%七氟醚處理12 h，C組及C+R組繼續(xù)培養(yǎng)12 h，DAPI染核后共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光點(diǎn)數(shù)。

1.4 自噬及mTOR途徑相關(guān)蛋白的測(cè)定 采用Western blot法測(cè)定自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Atg5以及p-mTOR、t-mTOR、β-actin的表達(dá)水平。于七氟醚處理結(jié)束后，各組吸去上清，使用預(yù)冷的PBS清洗兩次，加入裂解緩沖液RIPA 200 μl提取總蛋白，采用BCA檢測(cè)法測(cè)定蛋白含量。配平后取40 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗LC3B(1︰1 000)、Atg5(1︰1 000)、p-mTOR(1︰1 000)、t-mTOR(1︰1 000)和β-actin(1︰2 000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1︰3 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜后ECL顯色，采用化學(xué)發(fā)光高靈敏度凝膠成像與分析儀進(jìn)行曝光，并采用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞自噬檢測(cè)(mRFP-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物處理如1.2和1.3所述，處理結(jié)束后用冰PBS清洗兩次，加入5 μg/mL DAPI室溫孵育10 min染核，4%多聚甲醛固定，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，每組隨機(jī)選取40個(gè)細(xì)胞拍照，由非實(shí)驗(yàn)操作人員肉眼觀察并計(jì)數(shù)各組40個(gè)細(xì)胞合成圖片中mRFP-EGFP-LC3點(diǎn)的數(shù)量(綠色熒光、紅色熒光融合成黃色熒光點(diǎn)GFP+RFP+表示自噬小體，單獨(dú)的紅色熒光點(diǎn)GFP-RFP+表示自噬溶酶體)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次明確七氟醚對(duì)自噬流的影響及雷帕霉素在其中的作用。

2 結(jié)果

2.1 各組自噬相關(guān)蛋白LC3和Atg5的表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，與C組比較，C+R組、S組和S+R組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg5表達(dá)均增高(P<0.05)；與C+R組和S組比較，S+R組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg5表達(dá)也增高(P<0.01)(見(jiàn)圖1A、B、C)。

A.各組自噬相關(guān)蛋白條帶圖；B.F=54.73,P=0.000;C.F=37.82,P=0.000;D.F=168.9,P=0.000。*P<0.05，***P<0.001 vs. C組；##P<0.01，###P<0.001 vs. C+R組；$$P<0.01，$$$P<0.001 vs. S組。

2.2 各組mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，與C組比較，C+R組、S組和S+R組p-mTOR/t-mTOR比值均降低(P<0.001)；與C+R組和S組比較，S+R組p-mTOR/t-mTOR比值也降低(P<0.001)(見(jiàn)圖1A、D)。

2.3 各組自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量比較 mRFP-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，與C組比較，C+R組、S組和S+R組自噬小體、自噬溶酶體數(shù)量均增加(P<0.001)；與C+R組和S組比較，S+R組自噬小體、自噬溶酶體數(shù)量也增加(P<0.001)(見(jiàn)圖2)。

A.各組mRFP-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染熒光圖；B.F=214.2,P=0.000;C.F=136.7,P=0.000。***P<0.001 vs. C組；###P<0.001 vs. C+R組；$$$P<0.001 vs. S組。

3 討論

大量前期臨床研究表明七氟醚誘導(dǎo)發(fā)育神經(jīng)毒性[1-4]，減少神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。Piao等[10]研究發(fā)現(xiàn)七氟醚通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧來(lái)誘導(dǎo)發(fā)育大腦的神經(jīng)毒性，使用活性氧的抑制劑NAC可以顯著減輕七氟醚的神經(jīng)細(xì)胞損傷。自噬是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞內(nèi)自我吞噬的過(guò)程，主要去除受損的細(xì)胞器、聚集的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞內(nèi)病原體等[11]。Fan等[12]研究表明自噬降低SHSY-5Y細(xì)胞中活性氧的水平，抑制C2-神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)7日齡大鼠暴露于七氟醚可激活海馬神經(jīng)元的自噬，增加beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白水平；同時(shí)七氟醚增加海馬神經(jīng)元的凋亡，自噬可能在七氟醚發(fā)育神經(jīng)元毒性中發(fā)揮重要的作用[13]。在H4人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型中，Zhou等[14]研究顯示七氟醚誘導(dǎo)ERS并激活自噬，進(jìn)一步激活自噬可抑制ERS，減輕七氟醚介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，自噬可能成為七氟醚發(fā)育神經(jīng)毒性的有效預(yù)防和治療手段，進(jìn)一步探討七氟醚激活自噬的具體機(jī)制有助于改善其發(fā)育神經(jīng)毒性。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及前期研究基礎(chǔ)選用4.8%七氟醚(等效于臨床使用中的2 MAC)作用12 h，結(jié)果表明七氟醚激活SHSY-5Y細(xì)胞自噬，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Atg5蛋白表達(dá)水平，同時(shí)mRFP-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SHSY-5Y細(xì)胞，證實(shí)七氟醚誘導(dǎo)自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量均顯著增加，即自噬流增加。該結(jié)果與既往研究一致，七氟醚增加自噬，本實(shí)驗(yàn)使用mRFP-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，更清晰地顯示了自噬流的變化。

mTOR信號(hào)通路是參與自噬調(diào)控的主要負(fù)調(diào)控因子，與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，抑制mTOR信號(hào)通路可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[15]。PI3K/AKT/mTOR通路是抑制細(xì)胞自噬的經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Zhang等[16]研究表明七氟醚后處理可通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)大鼠心臟免受缺血再灌注損傷。Xu等[17]研究顯示在小鼠原代神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程中，吸入麻醉藥異氟醚通過(guò)激活mTOR途徑破壞突觸形成。然而，目前關(guān)于mTOR信號(hào)通路在七氟醚發(fā)育神經(jīng)毒性中的作用并未研究。本研究結(jié)果表明在SHSY-5Y細(xì)胞中，七氟醚抑制mTOR途徑，降低p-mTOR/t-mTOR，激活自噬；使用雷帕霉素可進(jìn)一步抑制mTOR途徑，增加自噬流。后續(xù)的研究需進(jìn)一步證明mTOR依賴性自噬在七氟醚發(fā)育神經(jīng)毒性中的作用，通過(guò)對(duì)mTOR信號(hào)通路的上下游信號(hào)分子進(jìn)一步研究并使用基因敲除方法證實(shí)其關(guān)鍵性作用。

綜上所述，本研究證明吸入麻醉藥七氟醚通過(guò)mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)SHSY-5Y細(xì)胞自噬的發(fā)生。