何曙光，袁平川，周凌云，湯 琳，汪 瑞，陳靠山

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241002)

菊芋俗稱洋姜，原產(chǎn)于北美洲，現(xiàn)在我國廣泛栽培，食用部位為其塊莖，目前畝產(chǎn)可高達4 000～15 000 kg，其鮮品中菊糖含量約占10%～20%，是生產(chǎn)菊糖的主要原料[1]。菊芋塊莖中富含菊糖、礦物質(zhì)、維生素，且低脂肪低熱量，在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域具有特殊價值[2]。研究發(fā)現(xiàn)，菊糖具有清除氧自由基減少氧化損傷的作用[5]，長期服用菊糖可改善人的血脂和血糖水平[3]；同時菊糖具有益生素和雙歧因子作用，可促進腸道中雙歧桿菌的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群，增強免疫力，降低胃腸疾病及腸癌的發(fā)病風(fēng)險[4]。據(jù)報道，菊芋塊莖在收獲后及室溫下儲存后極易發(fā)生重量減輕和變質(zhì)，主要表現(xiàn)為菊糖含量下降，還原糖增加[6]。本研究考察菊芋在不同處置方式下菊芋多糖的分子量變化以及生物活性影響，以期為菊芋進一步開發(fā)提供參考和指導(dǎo)。

1 材料與試劑

菊芋產(chǎn)自陜西省渭南市華州區(qū)金堆鎮(zhèn)，經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為菊科植物菊芋新鮮塊莖。葡聚糖標準品10 000、5 000、3 500、1 500、1 000 ku為色譜純，購自美國Sigma-Aldrich公司；DEAE-52纖維素、SuperdexG-75凝膠購自北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸、1 000 ku透析袋購自上海源葉生物科技有限公司；羥自由基測試試劑盒購自南京建成生物研究所；胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和DMEM和1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。其他試劑均購自國藥，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 實驗材料分組及處理 所有菊芋均產(chǎn)自同一塊田地。每組提取如下：①10月中旬應(yīng)季正常采收，作為正常采收組(ZCCS)；②應(yīng)季采收后，用烘干后的干沙掩埋，裝箱密封，在4℃條件下保存至次年3月，作為砂藏組(SC)；③延遲至第2年3月發(fā)芽前采收樣品，為延遲采收組(YCCS)。

2.1.2 菊芋多糖的提取 取各組處置后的新鮮樣品，經(jīng)過洗凈、切片、烘干(60℃)、粉碎、過篩，得菊芋干粉，備用。各組同時提取，其流程如圖1[7-8]。

圖1 菊芋多糖的提取流程圖

2.1.3 分子量測定 采用高效凝膠過濾色譜法(HPSEC)檢測多糖的分子量。色譜分析條件：示差折光檢測器；色譜柱：TSKgel G3000PW(7.8 mm×300 mm)；進樣量：20 μL；流動相為超純水，流速為0.7 mL/min；柱溫箱及檢測池溫度40℃。

精密稱取樣品和各葡聚糖標準品，分別配制成5 mg/mL溶液，0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.5 mL EP管中等待進樣[9]。

2.1.4 羥自由基清除實驗 本研究采用Fenton反應(yīng)考察多糖對OH·的清除作用。在進行正式檢測之前需要進行預(yù)實驗，從每組中取幾個樣本，確定最佳濃度和最佳取樣量；本實驗采用羥基自由基測定試劑盒，利用Griess試劑與體系中羥基自由基發(fā)生顯色反應(yīng)，測定顯色物質(zhì)的吸光值。樣品溶液用超純水配制成8個不同的梯度濃度，以等體積超純水代替多糖樣品溶液測定空白對照組吸光值，以等體積超純水代替工作液測定樣品本底吸光值(實驗重復(fù)3次，每次共5個平行管)。在550 nm處測定吸光值，計算OH·的清除活性，公式如下[10]：

抑制率=[1-(As-A0)/Ac]×100%，其中As為樣品組吸光值，A0樣品本底吸光值，Ac為空白對照組吸光值。

2.1.5 CCK-8檢測小鼠結(jié)腸癌細胞CT26的抑制實驗 培養(yǎng)CT26細胞到對數(shù)期。將多糖溶于RPMI-1640培養(yǎng)基中，配置成不同濃度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)留存。將均勻懸浮的CT26細胞接種于密度為5×103細胞/孔(每孔100 μL)的96孔板中，孵育24 h，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入配置好的不同濃度的多糖培養(yǎng)基100 μL，每個濃度設(shè)5個平行孔，各組加樣后孵育24 h(以等體積培養(yǎng)基代替多糖樣品溶液測定空白組)。在各孔分別加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h后。使用全自動酶標儀在450 nm處測量溶液的吸光度[11](實驗重復(fù)3次)。計算公式如下：

抑制率=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%，其中OD樣品和OD對照分別是各濃度多糖組和空白組的吸光度。

2.1.6 CCK-8檢測巨噬細胞RAW264.7增殖實驗 培養(yǎng)264.7細胞到對數(shù)期。將多糖溶于DMEM培養(yǎng)基中，并提前配置成各種濃度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)留存。將懸浮均勻的對數(shù)期RAW264.7細胞接種于密度為5×103個細胞/孔(每孔100 μL)的96孔板中，孵育24 h，待細胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，每孔加入不同濃度的多糖培養(yǎng)基100 μL，每個濃度設(shè)5個平行孔，各組加樣后孵育24 h(以等體積培養(yǎng)基代替多糖樣品溶液測定空白組)。接著在每孔加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h后[12]，使用全自動酶標儀在450 nm處測量溶液的吸光度(實驗重復(fù)3次)。計算公式如下：

相對增殖率=(OD樣品-OD空白)/OD空白×100%，其中OD樣品和OD對照分別是各濃度多糖組和空白組的吸光度。

2.2 結(jié)果

2.2.1 處置方式對多糖分子量的影響 經(jīng)液相檢測可知：ZCCS組菊芋多糖保留時間為12.441 min，SC組為12.576 min，YCCS組為12.715 min。YCCS組菊糖分子量相對較小，ZCCS、SC兩組多糖分子量無明顯差異(圖2)。SC組多糖分子量分布較廣，ZCCS組和C組分子量分布較集中(表1)。

表1 各組菊芋多糖分子質(zhì)量對照表

圖2 3種處置方式后菊芋多糖液相色譜分析

2.2.2 不同處置方式所得菊芋多糖對OH·清除作用 ZCCS、SC、YCCS 3組多糖在8 mg/mL濃度時對OH·清除率分別為50.89%、27.82%和49.56%，且3組多糖在實驗濃度為5 mg/mL與8 mg/mL時兩兩比較，ZCCS組和YCCS組多糖對OH·均具有較強的清除能力，SC組多糖的清除能力相對較弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖3A)。

A.菊芋多糖對OH·自由基清除率菊芋多糖對CT26細胞的抑制率菊芋多糖作用RAW264.7細胞的增殖率代表兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.3 對小鼠結(jié)腸癌細胞CT26的抑制效果 小鼠結(jié)腸癌細胞CT26的抑制實驗表明(圖3B)，當3組多糖樣品濃度為1.6 mg/mL時，3組菊芋多糖對CT26細胞的抑制率分別15.44%、8.32%和16.89%，且在樣品濃度為0.4 mg/mL和1.6 mg/mL時，3組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；此時活性強弱順序為ZCCS>YCCS>SC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。本實驗所用的3組多糖對CT26細胞都有一定抑制作用，其中SC組多糖在抗腫瘤方面的活性相對薄弱。

2.2.4 對巨噬細胞RAW264.7增殖作用 巨噬細胞RAW264.7增殖作用實驗表明(圖3C)，3組多糖濃度為1.6 mg/mL時，3組多糖對巨噬細胞RAW264.7的增殖率分別54.54%、28.32%和51.23%，且在樣品濃度為0.2 mg/mL和1.6 mg/mL時，3組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；此時活性強弱順序為ZCCS>YCCS>SC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。3組菊芋多糖中，SC組多糖增殖作用相對較弱。

3 討論

菊糖具有抗氧化，改善血脂和調(diào)節(jié)血糖的功效，同時還可以調(diào)節(jié)腸道菌群，增強免疫力，降低胃腸疾病及腸癌的發(fā)病風(fēng)險[3-5]。本研究通過3種處置方法得到不同的菊芋多糖并分析了3組多糖的分子量和生物活性的差異。實驗結(jié)果表明：3組菊芋多糖分子量有明顯差異，其中SC組分子量分布較廣，ZCCS組和YCCS組分子量分布集中。菊芋多糖具有獨特的分子量范圍，其聚合度2～100，菊芋多糖的長度、組成和分散性取決于收獲時間、提取前處理和提取后過程，且活性最好的多糖是富含聚合度<30的菊芋多糖[9]?？寡趸钚苑矫妫琒C組相比另兩組多糖活性較弱。OH·清除能力與抗氧化物質(zhì)供電子能力相關(guān)[13]，由于3種多糖都是菊芋多糖，所以SC組多糖清除能力下降可能是由于在處置過程中消耗了自身一部分有供電能力的多糖。3組多糖均具有一定的抑制腫瘤細胞活性，其中SC組多糖活性較弱。目前，多糖的抑制腫瘤生長作用已經(jīng)被很多的研究者證實，主要機理有：①口服多糖大大減少腫瘤的發(fā)生率；②部分種類多糖可以直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，從而達到抗癌的作用；③增強免疫力，加強巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用;④直接抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散[14]。3組多糖的巨噬細胞增殖活性也出現(xiàn)了SC組較弱的現(xiàn)象。巨噬細胞屬免疫細胞，其主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行噬菌作用，并激活淋巴球或其他免疫細胞，令其對病原體作出反應(yīng)，在機體免疫過程中起至關(guān)重要的作用[12]。由于菊芋塊莖在收獲后及室溫下儲存后菊糖含量下降，還原糖增加[6]。結(jié)合實驗結(jié)果，菊糖會隨著儲存過程品質(zhì)會逐漸下降，這對于菊芋塊莖的儲存和加工起著關(guān)鍵的指導(dǎo)意義。

本實驗結(jié)果證明，在經(jīng)過不同處置方式之后可以得到不同分子量、不同聚合度以及活性強弱不同的菊芋多糖。這與特定聚合度的多糖含量有關(guān)。在處置過程中SC組菊芋消耗了自身的多糖，導(dǎo)致其活性出現(xiàn)了下降，雖然多糖分子量只降低了一點，但是其多糖分子量分布變廣，抗氧化、抑制腫瘤以及免疫活性的降低，說明了菊芋內(nèi)部多糖聚合度發(fā)生了變化，即特定聚合度的多糖含量下降；在延遲采收過程中，菊芋自身的消耗可以從土壤中吸取，但其多糖分子量的減少，以及活性的略微降低，也在提醒著我們菊芋內(nèi)部多糖聚合度發(fā)生了微量的變化。

通過不同處置方法得到不同活性的多糖對提高菊芋多糖生物活性具有重要指導(dǎo)意義。目前菊芋多糖生物活性與分子量及多糖聚合度的關(guān)系研究較少，由以往報道可知[8-9,15]，菊芋多糖的生物活性與特定聚合度的多糖有關(guān)。本實驗為進一步深入研究菊芋多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、含量、各聚合度的比例及生物學(xué)功能提供了參考，也為研究菊芋多糖與藥理活性的構(gòu)效關(guān)系提供了研究思路。