梁莎 王施元 劉羽 王超 張玉紅 白潔明 王宇欣 公丕東 劉梅梅

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見的一種內(nèi)分泌異常所致的疾病，以稀發(fā)排卵或無排卵、高雄激素血癥、超聲提示卵巢多囊改變、生育力下降等為臨床主要特點，在19～25歲女性中發(fā)病率可達5%～7%[1]。其發(fā)病機制至今未明。有研究表明：育齡期PCOS患者卵巢超聲影像主要是以卵巢體積、卵巢間質(zhì)面積比增大,小卵泡數(shù)目增多,間質(zhì)回聲增強,卵巢間質(zhì)血流豐富為表現(xiàn)特征[2]。超聲顯示PCOS患者的卵巢間質(zhì)血流豐富、波峰較為圓頓，呈高速低阻力型，并且隨月經(jīng)時間而變化[3]。血管生成失調(diào)可能是PCOS發(fā)生發(fā)展的主要原因之一[4]。

凝血酶敏感蛋白1(thrombin sensitive protein-1，TSP-1)又稱為血小板反應(yīng)蛋白-1，是一種重要的抑制血管生成因子，可通過與多種受體結(jié)合，抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移、誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡。TSP-1 主要部分序列可通過CD36 信號途徑誘導(dǎo)凋亡，CD36 是 TSP-1 抑制內(nèi)皮細胞遷移和抗血管新生的一關(guān)鍵受體[5]。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是血管內(nèi)皮損傷性疾病的共同致病因子，為目前公認的反映血管內(nèi)皮細胞損傷的特異性首選指標；其能刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的超氧離子，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能的損傷，引起血管內(nèi)皮功能紊亂；也是一種重要的血管生成因子參與血管生成[6]。

本研究擬通過檢測PCOS患者血清中TSP-1、ET-1、CD36的表達狀況，探討各血管因子與PCOS不同分型間的關(guān)系，揭示PCOS卵巢間質(zhì)血流的變化原因，為進一步了解PCOS的發(fā)生發(fā)展提供一定的實驗基礎(chǔ)。

對象與方法

1.研究對象:選取2016年3月—2017年5月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖中心就診的PCOS的患者223例作為實驗組；選取同時期就診因男性因素不孕的育齡期正常女性62例作為正常對照組。所有入組患者均排除全身炎癥性疾病、甲狀腺疾病、高泌乳素血癥、腎上腺疾病、高血壓、糖尿病等合并癥及并發(fā)癥，近6個月內(nèi)無任何激素類藥物服用史。

2.分組:按鹿特丹國際會議制定的診斷標準與中國(2011年)PCOS診斷標準：①稀發(fā)排卵或無排卵的臨床表現(xiàn)包括：a.月經(jīng)稀發(fā)：月經(jīng)周期長度為35天～6個月；b.閉經(jīng)：繼發(fā)閉經(jīng)(停經(jīng)時間≥6月)或原發(fā)閉經(jīng)(16歲尚無月經(jīng)初潮)；c.不規(guī)則子宮出血：月經(jīng)周期或經(jīng)期或經(jīng)量無規(guī)律性。②臨床或生化上有高雄激素表現(xiàn)的臨床表現(xiàn)為：a.高雄激素癥狀：痤瘡、多毛(以Ferriman-Gallwey體毛評價標準[7]，F(xiàn)-G評分≥6分診斷多毛)、超重(BMI≥24 kg/m2)、黑棘皮癥等；b.血清生殖激素濃度測定：高雄激素血癥(總睪酮值>0.48 ng/ml)。③超聲檢查顯示卵巢多囊性改變(PCO):一側(cè)或雙側(cè)卵巢內(nèi)直徑2～9 mm的卵泡數(shù)≥12個，和(或)卵巢體積≥ 10cm3[卵巢體積按0.5X長徑(cm)X橫徑(cm)X前后徑(cm)計算]。并排除可能引起高雄激素的疾病和引起排卵異常的疾病如：甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥、遲發(fā)型腎上腺皮質(zhì)增生、21羥化酶缺乏癥、柯興氏綜合征、原發(fā)性卵巢功能減退或卵巢早衰、卵巢或腎上腺分泌雄激素腫瘤、功能性下丘腦性閉經(jīng)等。符合①②③條者為HOP組；符合①③條者且不符合②條者為OP組；符合①②條者且不符合③條者為HO組；符合②③條者且不符合①條者為HP組。

正常對照組納入標準：① 因男方不育因素就診的患者；②月經(jīng)規(guī)律，無PCOS臨床表現(xiàn)；③內(nèi)分泌水平無異常，包括性激素水平、口服葡萄糖耐量試驗、胰島素抵抗；④超聲下子宮及雙側(cè)卵巢無異常改變。

3.實驗方法

(1)血清樣本的收集。所有入組者均于卵泡早期(月經(jīng)周期第2～4 日)或閉經(jīng)2個月以上(排除妊娠)，經(jīng)陰道超聲檢查雙側(cè)卵巢內(nèi)無優(yōu)勢卵泡時，于晨起空腹抽取外周靜脈血5 mL，置于離心管中，后置于離心機中以2 000 r/min給予離心后，取其血清凍存于-20℃冰箱中備用。

(2)血清中TSP-1、CD36、ET-1水平的測定。采用酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒說明書要求依次分別檢測所有患者血清中TSP-1、CD36、ET-1水平。

結(jié)果

本實驗共納入患者285例：正常對照組62例；PCOS患者223例，其中HOP組48例，OP組58例，HO組63例，HP組54例。

1.PCOS組和正常組一般資料比較：PCOS組體重、BMI均高于正常對照組(P<0.05)，年齡、身高以及F-G評分兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組患者一般臨床資料比較

2.各亞型間血管因子TSP-1、CD36、ET-1的比較：PCOS組血清中ET-1的表達水平高于正常對照組(P<0.05)。PCOS亞型間比較，血清ET-1水平HOP組高于其他組(P<0.05)。PCOS組血清中TSP-1、CD36的表達水平低于正常對照組(P<0.05)。PCOS亞型間比較血清TSP-1、CD36水平HOP組低于其他組(P<0.05)，見表2。

表2 各組患者的血管因子的比較

3. PCOS患者TSP-1、ET-1、CD36相關(guān)性分析：通過分析血清學(xué)指標可以發(fā)現(xiàn)TSP-1、CD36的表達PCOS組低于正常對照組(P<0.05)；ET-1的表達PCOS組高于正常對照組(P<0.05)。各因子在PCOS組各亞型間的表達：①CD36：HOP組患者明顯低于其他各型，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.005，0.009，0.002)，OPHO組，HP>HO組，且都有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.035，0.037)。各因子之間的相關(guān)性分析為TSP-1與CD36之間呈顯著正相關(guān)，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖1；ET-1與CD36,TSP-1與ET-1之間不相關(guān)，見圖2、圖3。

圖1 TSP-1與CD36的相關(guān)性分析

圖2 ET-1與CD36的相關(guān)性分析

圖3 TSP-1與ET-1的相關(guān)性分析

討論

1.PCOS不同亞型：各國根據(jù)國情陸續(xù)出現(xiàn)各種關(guān)于PCOS的診斷標準，然而由于病因不清，臨床表現(xiàn)具有顯著的個體差異，各種診斷標準都缺乏循證醫(yī)學(xué)的有力證據(jù)。2003年出臺的鹿特丹診斷標準至今被廣泛應(yīng)用，本研究主要參考鹿特丹診斷標準，將納入研究的多囊卵巢綜合征患者分為4個臨床亞型。不同亞型的PCOS患者的實驗室指標和代謝水平也不相同。有研究發(fā)現(xiàn)HOP組的膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均高于其他各組，且與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義，說明HOP組引起的脂代謝紊亂是最嚴重的；而HP組患者則更容易引起糖代謝紊亂[8]。對于PCOS不孕癥的患者來說，不同亞型患者因其體內(nèi)的激素水平不同，其妊娠結(jié)局以及妊娠早期胚胎丟失和自然流產(chǎn)率也是不同的，所以治療方案也有所不同。因此，分析不同亞型的多囊卵巢綜合征的臨床和實驗室指標的特征，對臨床個體化治療具有有效的指導(dǎo)意義，從而達到最理想的治療效果。

2.PCOS與血管相關(guān)研究：實驗發(fā)現(xiàn)卵巢組織的血流灌注呈周期性變化[9]。異常的卵巢血管生成將導(dǎo)致相關(guān)的卵巢病變，如彩色多普勒超聲顯示：PCOS患者的卵巢以卵巢間質(zhì)及卵泡的血管增生、血流豐富而引起的卵巢增大的為主要特征[10]，卵巢間質(zhì)及卵泡周圍的膜部血管增生，血流豐富，波峰圓頓，呈高速低阻力型。血管增生是新生血管生成的同時血管內(nèi)皮細胞凋亡減少，調(diào)控血管生成的因子與調(diào)控抑制血管生成的因子功能失常，最終導(dǎo)致血管生成比例失調(diào)。

(1)TSP-1/CD36與PCOS相關(guān)性。本課題組之前初步的研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的血清中TSP-1的表達下降，提示TSP-1可能與PC0S存在相關(guān)性，考慮可能與血管生成或炎性反應(yīng)有關(guān)[11]。TSP-1的CSVTCG序列和GVQXR序列可與CD36結(jié)合，激活p38應(yīng)激激酶和半胱天冬酶，從而抑制內(nèi)皮細胞增殖[12]。抑制TSP-1的受體CD36能夠減少卵泡凋亡，促進顆粒細胞的增殖。PCOS組患者的卵巢組織中CD36的表達明顯降低，且可能和其遠期并發(fā)癥如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等具有共同的易感基因。本實驗研究結(jié)果顯示PCOS患者血清中TSP-1和CD36呈顯著正相關(guān)，且HOP組患者血清學(xué)TSP-1的值明顯低于其他各組，與HO與OP組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，而臨床上PCOS患者中又以HOP組患者癥狀最為典型，引起的脂代謝紊亂最為嚴重，為進一步實現(xiàn)個體化治療提供了思路；HO組患者無卵巢多囊樣改變，但本實驗測得其血清TSP-1水平與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義，而CD36水平與正常組相比則無太大差異，盡管不能排除實驗過程中因樣本量較少或其他因素引起的誤差，但也有可能提示了這部分患者存在一些微小血管的增生。血管的異常生成與調(diào)節(jié)血管生成的各細胞因子密不可分。

(2)ET-1與PCOS相關(guān)性。近年來很多的實驗都證明了，ET-1參與新生血管的各個階段，如內(nèi)皮細胞增殖、侵襲基底膜、釋放蛋白酶、微血管形成等。ET-1作為血管生長因子通過促使細胞增殖、遷移、抑制其凋亡并促進血管生成因子VEGF的分泌[13]最終起到促進血管生成作用。其通過與卵巢組織內(nèi)的相應(yīng)受體相結(jié)合通過調(diào)節(jié)血管的舒縮活動，來實現(xiàn)對卵巢血流的調(diào)控。Wenner等研究發(fā)現(xiàn)ET-1具有ET-A和ET-B兩種特異受體，前者起收縮作用，后者起舒張作用，主要分布于血管內(nèi)皮細胞[14]。故推測PCOS患者的卵巢間質(zhì)血流的增加可能與ET-1的舒血管作用增強和新生血管增加有關(guān)，具體機制有待進一步研究證實。但Foltyn等認為PCOS患者ET-1血清表達水平與正常女性并無區(qū)別[15]。這與本實驗發(fā)現(xiàn)了PCOS各亞型患者的血清ET-1水平都高于正常對照組，且都有統(tǒng)計學(xué)意義的觀點相悖。

3.實驗的意義與局限性:通過實驗可知，PCOS患者的卵巢血管生成增加與促血管生成因子和抑制血管生成因子之間關(guān)系密切，三者之間相互作用，互為因果。通過對PCOS患者的分型，可以使后續(xù)的臨床治療更有個體化。但是本實驗仍存在一些不足，其一，用患者外周血清中的因子水平來代表卵巢血管的變化，仍不足以讓人信服，通過大量文獻，可以認為卵泡液中血管因子的變化要優(yōu)于外周血。其二，PCOS患者的顯著特征為激素水平的紊亂，若本實驗?zāi)芙Y(jié)合患者的激素水平和糖脂代謝等指標綜合分析，將更具有說服力。