顧 宇，楊 雪，徐晨希，嚴(yán)浩軍，張樹(shù)明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”[1]，又稱“玄及”“會(huì)及”“山花椒”“五梅子”等[2-4]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品[5]，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴和心悸失眠等病癥[1]。五味子具有較高的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不僅是許多中成藥的重要原料，而且常被加工為保健飲品，市場(chǎng)需求量逐年增加，擁有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

五味子主產(chǎn)于東北、內(nèi)蒙古東部等地[6]，在黑龍江省則主要分布于東部和北部的山區(qū)及半山區(qū)，集中在大興安嶺、小興安嶺、張廣才嶺、老爺嶺、完達(dá)山等地區(qū)[7]，且已被列入重點(diǎn)發(fā)展的“龍九味”之一。現(xiàn)代研究表明，環(huán)境因素對(duì)中藥材質(zhì)量的影響是復(fù)雜而至關(guān)重要的。目前，對(duì)于五味子的研究大多集中于揮發(fā)油、木脂素等化學(xué)成分及其藥理作用，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的研究相對(duì)較少。本研究對(duì)黑龍江省14個(gè)產(chǎn)區(qū)栽培五味子的總多糖、粗脂肪和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定和對(duì)比分析，為其在食品領(lǐng)域的深入研究和開(kāi)發(fā)提供參考和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 供試五味子來(lái)源于黑龍江省漠河市等8個(gè)縣市山區(qū)產(chǎn)區(qū)及東方紅林業(yè)局6個(gè)縣市平原產(chǎn)區(qū)，見(jiàn)表1。成熟期采集，曬干，除雜，經(jīng)張樹(shù)明研究員鑒定為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果實(shí)。粉碎并過(guò)3號(hào)篩備用。

表1 五味子采集地區(qū)及時(shí)間

1.2 試劑與儀器 葡萄糖(批號(hào)：RFS-P01211802022)、牛血清白蛋白(批號(hào)：RFS-N01711804026)：均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；蒽酮：北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：1023T021；石油醚(沸程：30～60 ℃)、考馬斯亮藍(lán)G250、三羥甲基氨基甲烷、無(wú)水乙醇、濃硫酸和濃鹽酸均為分析純。HWS-26恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSA-224S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；JE1001電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；SORVALLST 16R離心機(jī)：德國(guó)賽默飛世爾公司；UV-5200紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 五味子總多糖含量測(cè)定

2.1.1 0.2%蒽酮—硫酸溶液的制備 精密稱取0.5 g蒽酮置于250 mL量瓶中，緩慢多次加入濃硫酸充分溶解并定容至刻度線，搖勻，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取5.00 mg 經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品并置于50 mL的量瓶中，加入蒸餾水完全溶解，即得0.1 g·L-1的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 參照任麗佳等[8]的方法，并略作改動(dòng)。精密稱取1 g五味子粉末置于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，稱定質(zhì)量。水浴中回流提取2 h，放冷，稱重，補(bǔ)足質(zhì)量，離心，精密量取2.0 mL上清置于離心管中，并加入10.0 mL無(wú)水乙醇，搖勻，靜置半小時(shí)，離心，棄上清，用適量蒸餾水充分溶解沉淀并定容至25 mL的量瓶中，搖勻，待測(cè)。

2.1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL葡萄糖對(duì)照品溶液置于10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得工作曲線系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。精密量取上述溶液各1.0 mL置于10 mL棕色具塞試管中并加入4 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，充分振搖混勻后迅速放入沸水浴中顯色10 min,隨即置于冰水浴中冷卻10 min，取適量溶液加入到比色皿中，以相應(yīng)試劑為空白，于600 nm處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

2.1.5 樣品總多糖的測(cè)定 依照“2.1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，然后按照“2.1.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算五味子樣品中總多糖的含量。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 分別精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液和尚志市栽培種(山區(qū))五味子供試品溶液各1.0 mL,按照“2.1.4”項(xiàng)下的方法連續(xù)測(cè)定6次。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取尚志市栽培種(山區(qū))五味子粉末1 g,共計(jì)5份，制備供試品溶液并依照“2.1.4”的方法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取尚志市栽培種(山區(qū))五味子制備的供試品溶液和葡萄糖對(duì)照品溶液各1.0 mL，分別按照“2.1.4”的方法顯色，于0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定尚志市栽培種(山區(qū))五味子粉末0.5 g置于錐形瓶中，共計(jì)6份，分別加入1 mL濃度為6.2 g·L-1的葡萄糖對(duì)照品溶液及50 mL的蒸餾水，稱定質(zhì)量。按照“2.1.3”方法制備供試品溶液，并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算RSD值。

2.2 五味子粗脂肪含量測(cè)定 精密稱取五味子粉末2 g置于濾紙包內(nèi)，105 ℃干燥箱中干燥2 h，在干燥器內(nèi)冷卻，稱定質(zhì)量。將濾紙包置于索氏提取器內(nèi)，加入適量石油醚，55 ℃水浴回流提取約6 h，直至玻璃棒蘸取提取液在濾紙上無(wú)殘留的油漬為止。取出濾紙包，揮干殘留的石油醚，置于105 ℃干燥箱中干燥至恒重。根據(jù)濾紙包減失的重量計(jì)算待測(cè)樣品中粗脂肪的含量。

2.3 五味子蛋白質(zhì)含量測(cè)定

2.3.1 酸性染色液的制備 精密稱定0.1 g考馬斯亮藍(lán)G250置于1000 mL量瓶中，加入50 mL乙醇使之完全溶解，緩慢加入100 mL磷酸，并用蒸餾水定容至刻度線，混勻，過(guò)濾，備用。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定5.00 mg牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL量瓶中，加蒸餾水充分溶解并定容至刻度線，混勻，即得濃度為0.5 g·L-1的牛血清白蛋白對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 參考萬(wàn)志強(qiáng)等[9]的方法略作修改。精密稱取3 g五味子粉末置于錐形瓶中，加入Tris-HCl緩沖液(50 mmol·L-1，pH 7.0) 30 mL，攪拌提取1 h，靜置，離心，過(guò)濾，精密量取1.0 mL濾液置于10 mL量瓶中，并加Tris-HCl緩沖液稀釋至刻度線，搖勻，待測(cè)。

2.3.4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別精密量取0.05、0.l、0.2、0.3、0.4、0.5 mL濃度為0.5 g·L-1的牛血清白蛋白對(duì)照品溶液置于10 mL棕色具塞試管中，并加蒸餾水至1 mL，即得工作曲線系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別加入5.0 mL酸性染色液，立即混勻，以相應(yīng)試劑為空白，于595 nm處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，與其相對(duì)應(yīng)的吸光度作為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程。

2.3.5 樣品蛋白質(zhì)的測(cè)定 按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，然后按照“2.3.4”的方法測(cè)定，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 分別精密量取牛血清白蛋白對(duì)照品溶液及饒河縣栽培種(山區(qū))五味子供試品溶液各1.0 mL,按照“2.3.5”的方法測(cè)定6 次。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取5份饒河縣栽培種(山區(qū))五味子粉末3 g，按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依照“2.3.5”項(xiàng)下的方法對(duì)其蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密量取1 ml饒河縣栽培種(山區(qū))五味子制備的供試品溶液和牛血清白蛋白對(duì)照品溶液，按照“2.3.5”的方法顯色，于0、5、10、15、20 min時(shí)測(cè)定吸光度。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取饒河縣栽培種(山區(qū))五味子粉末1.5 g置于錐形瓶中，共計(jì)6份，分別加入4.5 g·L-1的牛血清白蛋白對(duì)照品溶液1 mL和30 mLTris-HCl緩沖液，按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依照“2.3.5”的方法顯色并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算RSD值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 樣品總多糖的測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 經(jīng)過(guò)試驗(yàn)測(cè)定可以得知葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=8.5789x-0.0191，r=0.9993，說(shuō)明五味子的總多糖濃度在0.01～0.1 g·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)測(cè)得葡萄糖對(duì)照品溶液和尚志市栽培種(山區(qū))五味子供試品溶液吸光度的RSD分別為0.23%和0.31%(n=6)，說(shuō)明儀器精密度良好。重復(fù)性試中，RSD為1.18%(n=5)，說(shuō)明該方法有良好的重復(fù)性。穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為2.02%、0.98%，說(shuō)明五味子的總多糖在60 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。加樣回收率試驗(yàn)得到的平均加樣回收率為98.02%，RSD為1.14%(n=6)，符合方法學(xué)要求,說(shuō)明所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高。

3.2 樣品蛋白質(zhì)的測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可以得知蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=3.8162x+0.1572，r=0.9990，表明五味子的蛋白質(zhì)濃度在0.025～0.25 g·L-1范圍內(nèi)具備良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)表明牛血清白蛋白對(duì)照品溶液及饒河縣栽培種(山區(qū))五味子供試品溶液吸光度的RSD分別為0.19%和0.69%(n=6)，說(shuō)明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果表明其RSD為1.72%(n=5)，證明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，RSD分別為2.50%、1.36%，表明五味子的蛋白質(zhì)在20 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。加樣回收率試驗(yàn)，可知平均加樣回收率為98.47%，RSD為2.37%(n=6)，說(shuō)明所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高。

3.3 黑龍江省不同產(chǎn)區(qū)五味子總多糖、粗脂肪和蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 黑龍江省不同產(chǎn)區(qū)五味子的總多糖、粗脂肪和蛋白質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

由表1可知：黑龍江省不同產(chǎn)區(qū)五味子的總多糖百分含量在1.24%～1.95%之間，平均為1.59%；其中，呼瑪縣的五味子總多糖含量最高，為1.95%，而尚志市的五味子總多糖含量最低，僅為1.24%。平原區(qū)五味子的總多糖百分含量平均值為1.62%，山區(qū)的五味子則為1.56%。

粗脂肪含量在12.44%～17.80%之間，平均為15.63%；湯原縣五味子的粗脂肪含量最高，為17.80%，鶴北林業(yè)局的五味子則最低，為12.44%。山區(qū)五味子粗脂肪百分含量平均值為15.80%，平原區(qū)的五味子為15.41%。

蛋白質(zhì)含量在0.28%～1.20%之間，平均為0.69%；呼瑪縣的五味子含量最高，為1.20%，鶴崗市的五味子含量最低，為0.28%。山區(qū)五味子蛋白質(zhì)百分含量平均值為0.86%；平原區(qū)的五味子則為0.47%。

山區(qū)五味子的總多糖和粗脂肪的百分含量平均值與平原區(qū)的五味子差異較小，而山區(qū)五味子蛋白質(zhì)百分含量平均值是平原區(qū)的1.83倍，二者之間的差異較大。

3.4 黑龍江省不同產(chǎn)區(qū)五味子的綜合評(píng)價(jià)分析 以總多糖、粗脂肪和蛋白質(zhì)的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合評(píng)價(jià)指數(shù)的方法對(duì)黑龍江省不同產(chǎn)區(qū)栽培五味子的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。各指標(biāo)以其平均數(shù)為基準(zhǔn)向兩側(cè)等距分級(jí)，分級(jí)間距≈(最大值-最小值)/分級(jí)數(shù)，從低到高分為4個(gè)等級(jí)，分別對(duì)應(yīng)不同的指數(shù)值，即1、2、3、4[10]，見(jiàn)表3。根據(jù)表3的劃分等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，求出不同產(chǎn)區(qū)五味子所對(duì)應(yīng)的指數(shù)值并累加，即得其綜合評(píng)價(jià)指數(shù)。綜合評(píng)價(jià)指數(shù)越高，則五味子的品質(zhì)越好。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 五味子的品質(zhì)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及指數(shù)值

表4 黑龍江省不同產(chǎn)區(qū)五味子的品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

由表4可知：七臺(tái)河市的五味子綜合評(píng)價(jià)指數(shù)最高，品質(zhì)最佳；清河林業(yè)局、海林市和湯原縣次之；饒河縣和鶴北林業(yè)局的五味子綜合評(píng)價(jià)數(shù)最低，品質(zhì)較差。山區(qū)五味子綜合評(píng)分的平均值為8.50，平原區(qū)的五味子則為6.67，說(shuō)明山區(qū)栽培五味子的品質(zhì)優(yōu)于平原栽培五味子。

4 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道五味子多糖是五味子藥理活性成分之一，在保肝、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂以及提高免疫等方面具有顯著作用[11]，而且具有含量較高和毒性低的優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)是機(jī)體生命活動(dòng)中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者；脂肪是構(gòu)成機(jī)體組織細(xì)胞的重要成分之一；二者對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)具有重要作用和意義。本研究表明五味子的總多糖、粗脂肪和蛋白質(zhì)的含量均較高，粗脂肪的含量尤為突出。此外，萬(wàn)志強(qiáng)等[9]發(fā)現(xiàn)五味子蛋白質(zhì)中含有17種氨基酸，其中有6種為人體自身不能合成的必需氨基酸。由此可見(jiàn)，五味子極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。黑龍江省五味子的種植面積較廣，資源充足，如果合理地加以開(kāi)發(fā)利用，會(huì)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)效益。

黑龍江省14個(gè)產(chǎn)區(qū)五味子的總多糖、粗脂肪和蛋白質(zhì)的含量有所差別，一方面可能與當(dāng)?shù)氐耐寥李愋?、濕度、溫度、光照等生態(tài)環(huán)境有關(guān)。另一方面，五味子的樹(shù)齡、果穗掛果密度、果實(shí)采摘時(shí)間、干燥方式等因素也會(huì)對(duì)五味子待測(cè)成分的含量造成一定影響，有待進(jìn)一步研究。