姚曉霖，朱翮嘉

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科·浙江 杭州 310003)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指過去3個月陰莖持續(xù)不能達到或維持足夠的勃起以進行滿意的性交，是一種常見的臨床疾病[1]。隨著生活習慣和飲食結構的改變，我國的ED發(fā)病率逐年升高[2]。作為糖尿病(diabetes mellitus，DM)的常見并發(fā)癥之一[3]，ED在糖尿病人群中的發(fā)病率比非糖尿病人群高出3倍[4]，近75%的糖尿病患者存在不同程度的ED，且發(fā)病年齡較非糖尿病人群更早，癥狀也更嚴重[5]。

勃起受到內(nèi)皮細胞和海綿體平滑肌細胞(Corpus carvernosum smooth muscle cells, CSMCS)中諸多因素的調(diào)節(jié)。先前的研究表明，糖尿病神經(jīng)病變和血管病變是糖尿病性ED的主要原因，且陰莖海綿體平滑肌細胞的過度凋亡是導致ED發(fā)生的重要機制之一[6]，線粒體損傷可引起陰莖海綿體平滑肌細胞過度凋亡[7]。5型磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase type 5 inhibitor, PDE5I)是治療ED的常用藥物，但對DM ED無效[8-9]。傳統(tǒng)中藥在糖尿病及其并發(fā)癥的治療中以整體調(diào)節(jié)為主，可改善臨床癥狀，減少西藥引起的不良反應，防止并發(fā)癥的產(chǎn)生[10]。靈芝孢子粉水溶提取物靈芝多糖具有多種藥理作用，在控制血糖、提高胰島素敏感性、增強胰島β細胞功能、改善糖尿病并發(fā)癥方面有較好的效果[11-13]。然而，關于靈芝多糖治療糖尿病性ED的臨床與實驗研究尚未見報道。本研究通過DM ED動物模型研究靈芝多糖對糖尿病性ED的作用及機制，為靈芝多糖的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 42只SPF級健康雄性SD大鼠，6～7周齡，體質量(220±20)，購于上海斯萊克動物實驗有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2017-0015；在標準環(huán)境下(溫度：(23±2)℃，濕度：55%～70%，12 h 光/暗循環(huán))飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證：SCXK(浙)2020-0024，自由飲食飲水。所有動物實驗均參照實驗動物保護和使用指南，并經(jīng)杭州鷹旸生物科技有限公司倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物 靈芝多糖 (B24477)：上海源葉生物；二甲雙胍(PHR1084-500MG)：Sigma公司。

1.3 實驗試劑與儀器 鏈脲佐菌素STZ(V900890-1G)：Sigma公司；APO(鹽酸阿撲嗎啡，100839)：中國食品藥品檢定研究院；線粒體提取試劑盒(SM0020)、BCA蛋白定量試劑盒(pc0020)：索萊寶公司；大鼠胰島素ELISA試劑盒(ml003344)：上海酶聯(lián)公司；丙二醛(MDA)測試盒(20180903)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(20180904)、ATP酶測試盒(20180908)：南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液(P0013D)：碧云天；Anti-p53(AF0879)、Anti-caspase-3(AF6311)、Anti-C-myc(AF0358)、Anti-Cyto C(AF0146)：Affinity公司；Anti-β-actin(EM21002)：華安公司。CMaxPius酶標儀：SpectiaMax公司；EPS300電泳儀、VE 180C電泳槽、VE186轉膜儀：上海天能公司。

1.4 模型構建 大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，禁食16 h。36 只大鼠腹腔注射 STZ(60 mg/kg)，同時將6只大鼠不做處理作為正常對照組。注射 STZ 7 d后測定空腹血糖，任意時間血糖 ≥16.7 mmol/L 為 DM模型建立成功，每周測血糖1次。糖尿病成模后用正常飼料繼續(xù)飼喂8周。DM ED模型篩選：動物稱重后分別放入實驗鐵籠中，房間燈光調(diào)暗，室內(nèi)盡量保持安靜，適應環(huán)境 10 min。將 APO 注射于大鼠頸部皮下皮膚松軟處(100 μg/kg)。錄像機觀察大鼠 30 min，龜頭充血、露出，包皮后退并且陰莖膨大計為勃起，未見勃起者且血糖水平(空腹)超過 7.2 mmol/L 為 DM ED 大鼠。

1.5 實驗分組及給藥 將成模 DM ED 大鼠隨機分為以下4 組：DM ED 模型組，二甲雙胍組[20 mg/(kg·d)，靈芝多糖低劑量組[100 mg/(kg·d)]和靈芝多糖高劑量組[400 mg/(kg·d)]，每組3只；另取3 只健康大鼠為健康對照組。靈芝多糖組和二甲雙胍組每日分別灌胃給予靈芝多糖水溶液和二甲雙胍水溶液，DM ED 模型組與正常組每日灌胃給予等劑量的生理鹽水，連續(xù)灌胃8周。

1.6 觀察指標及測定

1.6.1 一般狀況 每日觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動度、飲食飲水及排便情況，每周稱重并記錄體質量。

1.6.2 胰島素水平檢測 給藥結束后戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后處死大鼠后，腹主動脈采血，離心(5 000 r/min，10 min)分離血清，按照ELISA試劑盒說明檢測血清中胰島素的水平。

1.6.3 陰莖組織病理觀察 給藥結束后用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，處死后立即剝離陰莖海綿體組織，取陰莖組織放入10%的中性甲醛中固定，取材包埋切片。切片經(jīng)常規(guī)處理進行HE染色，光鏡觀察。

1.6.4 陰莖海綿體組織SOD活性、MDA 含量、Ca2+-Mg2+-ATPase活性檢測 大鼠處死后立即剝離陰莖海綿體組織，取部分組織制備勻漿，按照SOD和MDA試劑盒說明方法測定陰莖海綿體組織內(nèi) SOD活性與MDA的含量。取部分陰莖海綿體組織，按照Ca2+-Mg2+-ATPase檢測說明書進行實驗，636 nm 處檢測各樣本吸光度。

1.6.5 陰莖海綿體組織p53、caspase-3、C-myc與 Cyto C蛋白 的Western blot檢測

RIPA裂解液(含PMSF和蛋白酶抑制劑)提取陰莖海綿體組織中的蛋白質。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉移到PVDF膜，TBST洗膜后，用5%脫脂奶粉封閉1.5～2 h。然后將膜放入含一抗稀釋液(p53(1∶500)、caspase-3(1∶500)、C-myc(1∶500)、 Cyto C(1∶300)和Anti-β-actin(1∶10 000))的孵育盒中于4 ℃孵育過夜。隨后加入二抗在室溫下反應1～2 h?；瘜W發(fā)光儀顯影后用Image J 檢測條帶強度。

2 結果

2.1 靈芝多糖對DM ED大鼠一般狀況影響 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，動作靈活。DM模型大鼠多食、多飲、多尿、體質量增長緩慢，精神倦怠、活動減少、毛發(fā)無光澤。體質量變化見表1。

2.2 靈芝多糖對DM ED大鼠胰島素水平的影響 見表1。

表1 各組大鼠體質量和血清胰島素水平比較

2.3 靈芝多糖對DM ED大鼠陰莖組織病理學改變的影響 正常組大鼠陰莖海綿體由海綿體小梁和大量不規(guī)則血竇(海綿竇)構成，竇狀隙中可見部分紅細胞，血竇內(nèi)壁被以扁平的內(nèi)皮細胞。與正常組大鼠相比，DM ED組大鼠陰莖海綿體內(nèi)血竇數(shù)量及小血管數(shù)量明顯減少，血竇擴張充血明顯，海綿體平滑肌及內(nèi)皮細胞密度明顯降低，內(nèi)皮細胞腫脹明顯。二甲雙胍組、靈芝多糖高劑量組、靈芝多糖低劑量組上述病理變化均有不同程度改善，陰莖海綿體內(nèi)血竇數(shù)量及小血管數(shù)量明顯增加，其中二甲雙胍組效果最明顯。

圖1 各組大鼠陰莖組織病理學變化(HE，×400)

2.4 靈芝多糖對DM ED大鼠陰莖海綿體組織SOD、MDA、Ca2+-Mg2+-ATPase的影響 見表2。

表2 各組大鼠陰莖海綿體組織SOD活性、MDA含量及Ca2+-Mg2+-ATPase活性的比較

2.5 靈芝多糖對大鼠陰莖海綿體組織 p53、caspase-3、C-myc與 Cyto C蛋白表達的影響 見圖2。

注：與模型組比較，★P<0.05，★★P<0.01

3 討論

近年來，隨著人們生活方式的改變和人口老齡化，糖尿病的發(fā)病率逐年增加。糖尿病具有多種慢性并發(fā)癥，包括心臟病，高血壓，中風和ED；其中，糖尿病與ED關系最為密切，是器質性ED的主要原因[4]。靈芝性平，味甘，歸肺、心、肝、腎經(jīng)，其成分中多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗糖尿病、保護機體重要器官等作用[14]。在本研究結果可見，靈芝多糖能顯著增加DM ED 大鼠的體質量，升高體內(nèi)胰島素的水平，同時改善DM ED大鼠陰莖病理學改變。

氧化應激產(chǎn)物會導致NO生物利用度降低，進而導致DM ED大鼠勃起功能的惡化[15]。然而，過量產(chǎn)生的ROS阻斷SOD的作用，進一步降低陰莖NO的生物利用度[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可以顯著降低DM ED大鼠陰莖海綿體組織MDA含量，增加SOD和ATP酶的活性，說明具有抗氧化應激作用。

線粒體損傷是糖尿病性ED機制研究的熱點之一。線粒體是一個結構和功能復雜而敏感的重要細胞器，不僅是細胞的能量工廠，還是調(diào)控能量衰竭、細胞內(nèi)鈣離子超載及誘導細胞凋亡機制的重要組成部分[16-18]。研究表明凋亡是多基因和蛋白嚴格控制的過程，如p53、Bcl-2家族、caspase家族、C-myc等[19-20]，其中依賴caspase的線粒體途徑是細胞凋亡最經(jīng)典的途徑之一。藥物通過抑制caspase-3的活化，可以產(chǎn)生對糖尿病性勃起障礙的保護作用[21-22]。Cyto C是線粒體氧化呼吸的限速酶，直接參與線粒體氧的利用和能量產(chǎn)生。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如Cyto C等從線粒體釋放出來，從而發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導Cyto C的釋放，具有促凋亡作用，p53可以上調(diào)Bax的表達水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡作用[23-24]。本研究結果顯示，靈芝多糖可以抑制大鼠陰莖海綿體組織中凋亡因子的表達，從而改善糖尿病性勃起障礙。

綜上，通過本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的靈芝多糖能夠通過調(diào)節(jié)DM ED 的氧化應激和減輕線粒體損傷發(fā)揮作用，為DM ED 的治療提供了研究基礎和新的方向。