蔣鵬娜，張佩青，王麗潔

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院·黑龍江 哈爾濱 150040)

仙麻平喘湯是本院臨床用于治療哮喘的有效驗方，全方以“陽虛痰盛”立方，以溫陽益氣為主，兼以平喘化痰，綜觀全方溫陽利濕，陽氣足濕氣化，益氣納腎，一身之氣足則喘平氣順，補中有消，溫中有行，肺脾腎三臟同調(diào)，臨床使用多年療效可靠。本實驗是在前期實驗基礎(chǔ)上進行的關(guān)于仙麻平喘湯對哮喘模型小鼠肺組織損傷以及對氣道阻力的干預(yù)效果觀察，以期為該藥治療哮喘的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級健康雌性BALB/c小鼠50只， 8～12周齡，體質(zhì)量18～22 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黑)2019-03，于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物中心飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號SYXK(黑)2016-008，5只1籠，提前1 周進行環(huán)境適應(yīng)，實驗室溫度18～25 ℃，相對濕度40%～75%。

1.2 實驗藥物 仙麻平喘湯：淫羊藿、黃芪、麻黃、五味子、紫菀、細辛、射干、款冬花、半夏、生姜、大棗，上述中藥飲片均購于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院草藥局。仙麻平喘湯合煎液制備：分別稱取相應(yīng)劑量上述藥材，浸泡30 min，1煎8倍水，1.5 h，濾出藥液；2煎4倍水，1.5 h，濾出藥液；合并兩次藥液，轉(zhuǎn)移至旋蒸儀中濃縮，定容至濃度1.26 g生藥/mL，給藥劑量為25.2 g/(kg·d)，得到仙麻平喘湯合煎液。仙麻平喘湯混合液制備：分別稱取相應(yīng)劑量上述藥材分別浸泡30 min，分別以合煎組的時間、加水倍數(shù)條件煎煮，最后合并藥液；分別轉(zhuǎn)移至旋蒸儀中濃縮，各自定容至200 mL，最后混合藥液定容至1.26 g生藥/mL，劑量為25.2g/(kg·d)，得到仙麻平喘湯混合液。上述藥液別冷藏至-20 ℃冰箱保存，用時于-4 ℃冰箱保存。地塞米松磷酸鈉注射液(1 mL∶5 mg)：國藥準字H42020019，天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：52003281。

1.3 主要試劑及儀器 OVA卵蛋白：上海伯奧生物科技有限公司；乙酰膽堿：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。403H超聲霧化機：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；EMKA-WBP清醒小動物給藥和呼吸生理檢儀：法國EMKA Technologies；光鏡:OLYMPUS。

2 實驗方法

2.1 動物分組、模型制備及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，50只小鼠按照隨機數(shù)字表法分成5組，分別為正常對照組、模型組、地塞米松組、仙麻平喘湯合煎液組、仙麻平喘湯混合液組，每組10只。用OVA致敏以及激發(fā)進行造模[1]，周期為28 d，第1天與第8天在小鼠皮下和腹腔注射0.1 mL/只(每0.2 mL含OVA 0.1 mg,AL(OH)30.02 mg)進行OVA致敏，致敏后第15～28天，用5%OVA進行霧化，20 min/次，每天1次；正常組予生理鹽水注射或霧化。于致敏后第19天，地塞米松組予地塞米松磷酸鈉注射液(0.3 mg/kg)灌胃，仙麻平喘湯合煎液組予合煎液(25.2 g/kg)灌胃，仙麻平喘湯混合液組予混合液(25.2 g/kg)灌胃，正常組用等體積生理鹽水灌胃；每天1次，連續(xù)灌胃10 d。于第29天行檢測。

2.2 觀察指標及檢測方法

2.2.1 肺功能檢測 將實驗小鼠放入調(diào)整好的清醒小動物給藥和呼吸生理檢測儀激發(fā)室中，采用乙酰膽堿液進行激發(fā)，每次激發(fā)1 min，連續(xù)激發(fā)并進行記錄，激發(fā)濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00 g/L；記錄小鼠氣道阻力(RI)。

2.2.2 外周血嗜酸細胞(EOS)計數(shù) 肺功能測定完畢后，麻醉小鼠，目眶采血20 μL，加入EOS計數(shù)液0.38 mL，充分混合搖勻，調(diào)整顯微鏡目鏡倍數(shù)10×10，隨機選取10個大方格，并計錄EOS數(shù)量(X)。EOS數(shù)量=X×20×109個/L。

2.2.3 肺組織病理學(xué)觀察 腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，取右肺上葉用10%福爾馬林固定，嚴格按照HE染色步驟進行操作，先進行脫水，再石蠟包埋，然后切片、染色，并在光學(xué)顯微鏡下進行病理觀察。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺功能檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組小鼠氣道阻力(RI)測定結(jié)果比較

實驗結(jié)果表明：仙麻平喘湯合煎液、仙麻平喘湯混合液、地塞米松可以抑制不同濃度乙酰膽堿液(Ach)激發(fā)狀態(tài)下小鼠氣道的penh值，具有一定的緩解和干預(yù)作用，統(tǒng)計分析說明地塞米松組的抑制作用較明顯，而仙麻平喘湯合煎組以及仙麻平喘湯混合組與地塞米松組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 各組小鼠外周血EOS計數(shù)比較 見表2。

表2 各組小鼠外周血EOS計數(shù)比較

實驗結(jié)果表明，小鼠經(jīng)卵蛋白致敏和刺激后，小鼠體內(nèi)的應(yīng)激提高，出現(xiàn)過敏反應(yīng)，而且血液中EOS的計數(shù)也明顯增多，地塞米松、仙麻平喘湯合煎液、仙麻平喘湯混合液均對小鼠的EOS表達有明顯的抑制作用，三者比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 各組小鼠肺組織病理變化 正常組：正常肺小葉結(jié)構(gòu)，肺泡上皮細胞無變性﹑無壞死、無脫落，肺間隔、肺泡腔及支氣管腔、支氣管壁完整，細胞排列規(guī)整。模型組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞，肺泡上皮細胞壞死脫落，1/3肺組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤和肺泡壁充血，支氣管平滑肌厚度明顯增加，證明小鼠出現(xiàn)哮喘的病理表現(xiàn)。地塞米松組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞較輕，支氣管平滑肌厚度輕度增加，局部肺泡上皮細胞有壞死脫落，肺泡間質(zhì)內(nèi)具有輕度的炎性細胞浸潤。仙麻平喘湯合煎液組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞較輕，支氣管平滑肌厚度略有增加，局部肺泡上皮細胞有壞死脫落，肺泡間質(zhì)內(nèi)具有輕度的炎性細胞浸潤。仙麻平喘湯混合液組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞較輕，支氣管平滑肌厚度輕度增加，局部肺泡上皮細胞有壞死脫落，肺泡間質(zhì)內(nèi)具有輕度的炎性細胞浸潤。

圖1 各組小鼠肺組織病理觀察結(jié)果(HE，×200)

4 討論

支氣管哮喘是常見呼吸系統(tǒng)疾病之一，黃帝內(nèi)經(jīng)《素問·陰陽別論篇第七》中既有其相關(guān)癥狀的詳細論述“陰爭于內(nèi)，陽擾于外，魄汗未藏，四逆而起，起則熏肺，使人喘鳴”。在引起哮喘發(fā)病的眾多病因中，風(fēng)寒襲肺當居于首位，《證治心得》中的“風(fēng)寒之邪受自皮毛故得以入肺而為喘……”的記載；趙西斌等[2]總結(jié)兒童哮喘常由風(fēng)寒等外因以及肺脾腎三臟陽氣不足，兩寒相合，故氣逆而上導(dǎo)致哮喘。仙麻平喘湯以溫陽益氣為主，兼以平喘化痰，全方由臨床常用的經(jīng)典古方射干麻黃湯加淫羊藿、黃芪等而成。《金匱要略》有言：“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”，在辛鳳[3]報道的研究中發(fā)現(xiàn)，射干麻黃湯可減少哮喘患者EOS的增加，并能促進EOS的凋亡，能調(diào)控TRPV2 mRNA的表達，從而抑制神經(jīng)生長因子(NGF)、前列腺素(PGs)的過度釋放，減輕TRPV2誘發(fā)與促進氣道高反應(yīng)性和慢性炎癥的刺激，多環(huán)節(jié)治療哮喘。另外研究還發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯治療哮喘性肺炎大鼠肺組織中的炎癥因子IL-4、IL-13及TNF-α的表達與射干麻黃湯的劑量成負相關(guān)[4]。

仙麻平喘湯是在射干麻黃湯方中加入黃芪和淫羊藿，本方既可以增強機體免疫功能，還能對抗氧自由基，增強機體抗缺血、缺氧能力，另外黃芪在促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，減輕支氣管黏膜炎性水腫，改善臨床癥狀，減少環(huán)磷酸苷分解，松弛支氣管平滑肌，促進排痰，擴張血管，降低血流阻力等方面均有良好的療效[5]。另有研究證實，黃芪和淫羊藿聯(lián)合，不但能減輕哮喘氣道炎癥，提高療效，減輕患者對激素的依賴性,減少激素用量,而且還可改善下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能,促進內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的釋放[6]。

本實驗中用卵蛋白致敏小鼠后，又經(jīng)卵蛋白霧化刺激，導(dǎo)致小鼠的肺組織中炎癥細胞浸潤和肺泡壁充血，支氣管平滑肌厚度增加，說明造模的方法是可行的，而且血液檢查EOS也證明，小鼠血液中EOS的計數(shù)明顯增多，應(yīng)激增高，出現(xiàn)過敏反應(yīng)，實驗還通過清醒小動物給藥和呼吸生理檢測儀對小鼠的氣道阻力進行測定，同樣也證明小鼠的氣道有痙攣的存在。

從本次實驗發(fā)現(xiàn)，雖然小鼠氣道的反應(yīng)性和乙酰膽堿(Ach)的濃度成正相關(guān)，隨著Ach濃度的增加，小鼠氣道反應(yīng)性數(shù)據(jù)penh也增加，但仙麻平喘湯合煎液、仙麻平喘湯混合液以及地塞米松均有干預(yù)小鼠氣道高反應(yīng)的作用，最后結(jié)果表明，仙麻平喘湯合煎液與混合液的療效均可起干預(yù)效果，說明仙麻平喘湯有良好的宣肺平喘作用。