史海燕，史振國，張 超，王兆蒙，葛鶴年，劉 剛

(1寧波市康復(fù)醫(yī)院·浙江 寧波 315040；2浙江大學(xué)寧波醫(yī)院·浙江 寧波 315010)

益氣化瘀醒腦湯由川芎、地龍、水蛭等中藥組成，為寧波市康復(fù)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科在《壽世保元》卷五活血湯的基礎(chǔ)上，加減化裁形成的院內(nèi)協(xié)定方，對中風(fēng)類疾病臨床療效明確，但機制尚不明確。本研究旨在探討益氣化瘀醒腦湯對急性腦缺血模型大鼠腦組織病理變化的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康SD大鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購于浙江省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK-(浙)2018-0012，室溫飼養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.2 藥品與試劑 益氣化瘀醒腦湯組成：川芎10 g、地龍15 g、水蛭10 g、郁金10 g、石菖蒲15 g、膽南星10 g、生黃芪20 g、制首烏15 g、鉤藤10、仙靈脾10 g、枸杞子10 g、女貞子10 g、丹參20 g、全蝎10 g、僵蠶10 g，上述中藥飲片本院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，分別濃縮至含0.5、1.0、1.5 g/mL原藥材藥液。尼莫地平片：亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號：20181213，20 mg/片。水合氯醛：國藥集團化學(xué)試劑有限公司； HE和TTC試劑盒：武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；MDA和SOD試劑盒：碧云天生物科技有限公司；T-AOC 和GSH-Px試劑盒：武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 ELx800酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；CUT4062 型石蠟切片機與包埋機：德國SLEE公司；BX60顯微鏡：日本Olympus Optical 公司。

1.4 模型建立及分組 將60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組，模型組，益氣化瘀醒腦湯低、中、高劑量組和陽性組，每組10只。除正常對照組外，其他4組大鼠5%水合氯醛麻醉，采用改良閉塞線栓法栓塞大腦中動脈法建立實驗性腦缺血損傷大鼠模型[1]。大鼠右側(cè)背部脫毛，仰臥，四肢固定于手術(shù)臺板，頸部正中區(qū)域做豎形切口，鈍性分離雙側(cè)筋膜及腺體，充分暴露右側(cè)頸動脈，顯微鑷分離頸外動脈和頸內(nèi)動脈，靠近分叉處結(jié)扎頸外動脈，距右側(cè)頸總動脈分叉近端絲線結(jié)扎，在右側(cè)頸總動脈遠端置絲線打一活結(jié)備用，逐層縫合筋膜和皮膚，碘伏常規(guī)切口消毒。正常組除不插入線栓外其余手術(shù)過程相同。

1.5 給藥方法 造模24 h后，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，益氣化瘀醒腦湯低、中、高劑量組給予不同濃度的益氣化瘀醒腦湯灌胃，劑量均為10 mL/kg，1 次/d，給藥7 d。陽性組給予尼莫地平片，10 mg/kg，1 次/d，給藥7 d。

1.6 觀察指標(biāo)與檢測

1.6.1 神經(jīng)功能損傷程度測定 末次給藥24 h后評價神經(jīng)功能損傷程度，采用5分法[2]。0分：神經(jīng)功能正常；1分：提尾懸空前爪不能伸展；2分：行走出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈行為；3分：行走困難且向左側(cè)傾倒；4分：無自主活動、意識喪失。

1.6.2 腦梗死面積 采用TTC染色測定。腦片2%TTC染色液避光孵育0.5 h，10%甲醛固定，通過Image-Pro Plus 6.0 測量，梗死組織呈白色，正常腦組織呈紅色。梗死體積(%)=梗死體積/對側(cè)大腦半球體積×100%。

1.6.3 腦組織病理觀察 分別于末次給藥24 h后，取腦組織，PBS清洗，甲醛固定，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，乙醇水化，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.6.4 神經(jīng)細胞凋亡測定 取左半球腦組織，4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透明，5 μm冠狀切片，TUNEL法檢測，計算凋亡指數(shù)。

1.6.5 氧化應(yīng)激損傷因子測定 取血清，硫代巴比妥酸法測定MDA，水溶性四氮唑法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法按照說明書操作測定總抗氧化活力(T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積比較 見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積比較

2.2 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果 正常組腦組織正常，腦細胞排列有序，細胞輪廓清晰、結(jié)構(gòu)完整，無水腫，形態(tài)正常，未見異常。與正常組比較，模型組腦細胞明顯減少，大量細胞壞死且排列紊亂，梗死灶內(nèi)細胞和血管壞死、腦組織細胞疏松、形態(tài)改變、間質(zhì)水腫。益氣化瘀醒腦湯低、中、高劑量組和陽性組腦組織損傷減輕，細胞稍顯疏松，水腫減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)切片(HE染色，×100)

2.3 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡比較 見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡比較

2.4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)比較 見表3。

表3 各組大鼠血清MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px水平比較

3 討論

急性腦缺血受到缺氧缺血的影響，導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡，細胞經(jīng)歷腦氧化代謝受損、腫脹和細胞外興奮性氨基酸積累，體內(nèi)就會產(chǎn)生過多的氧化活性分子，加劇氧化損傷和組織損傷[3-4]。急性腦缺血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，氣虛則運血無力，血流不暢，而致腦絡(luò)瘀滯不通，痰濁、瘀血既是病理產(chǎn)物，又是致病因素，痰瘀互阻，壅滯腦絡(luò)，瘀血阻滯經(jīng)脈不通，元神受損、臟腑功能失衡[5-6]?；诖瞬C，應(yīng)治以應(yīng)益氣化瘀、醒腦解郁之法[7]。急性腦缺血病理生理學(xué)改變除神經(jīng)細胞壞死以外，還包括缺血區(qū)及周邊組織反應(yīng)性的血管新生，隨著缺血時間延長，出現(xiàn)了局部微血管損傷及反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生，導(dǎo)致局部組織水腫壞死[8]。腦組織缺血后，供氧中斷，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，造成組織損傷，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)對腦組織具有保護作用[9]。

益氣化瘀醒腦湯川芎、地龍、水蛭等組成，川芎活血祛瘀、行氣開郁；地龍咸寒降泄，性走竄，既能息風(fēng)止痙、又善清解高熱，長于通行經(jīng)絡(luò)；水蛭破血通經(jīng)、逐瘀消癥；郁金能清熱涼血、行氣解郁；石菖蒲具有開竅化痰、開郁行神、醒神益智的功效；膽南星歸肝、膽、肺經(jīng)，具有清火化痰、息風(fēng)定驚之功效；生黃芪能補一身之氣，使正氣充足推動血行；制首烏氣微，味微甘而苦澀，具有補肝腎、益精血功效；鉤藤具有息風(fēng)定驚、清熱平肝之功效；丹參活血祛瘀、除煩安神；全蝎息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)；僵蠶具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)之功效[10-11]。諸藥共用，起到益氣化瘀、醒腦開竅、化痰通絡(luò)的功效，正中急性腦缺血氣滯血瘀、腦絡(luò)痹阻、痰瘀阻滯之病機?，F(xiàn)代藥理研究顯示：方中川芎的主要活性成分為川芎揮發(fā)油，可改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，降低腦梗死率及MDA、LD、LDH水平，提高Ca2+-ATP酶活性,抑制細胞內(nèi)鈣超載，抑制炎性反應(yīng)等改善腦缺血再灌注損傷[12-13]。地龍可有效預(yù)防大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與增加血清SOD活性及降低LDH、MDA含量有關(guān)[14]。水蛭有擴張毛細血管、改善微循環(huán)、增加血流量的作用，通過抗炎、抑制平滑肌細胞、調(diào)控自噬、抗氧化等機制發(fā)揮治療心血管疾病的作用[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀醒腦湯低、中、高劑量組和陽性組腦組織損傷減輕，細胞稍顯疏松，水腫減輕，益氣化瘀醒腦湯低、中、高劑量組和陽性組MDA含量顯著降低，SOD、T-AOC和GSH-Px活性顯著升高。綜上所述，益氣化瘀醒腦湯可顯著降低急性腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能損傷和腦梗死體積，改善腦組織損傷，減少神經(jīng)細胞凋亡，其機制可能與減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。