馮麗輝，萬(wàn)雪峰，鄭忠蕊，韓海瑞，范明明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是肝功能酶學(xué)異常和慢性肝病最常見(jiàn)的原因，其危險(xiǎn)因素包括高脂肪高熱量的膳食結(jié)構(gòu)、多坐少動(dòng)的生活方式、胰島素抵抗、代謝綜合證如肥胖、高血壓、血脂紊亂和2型糖尿病等。NAFLD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,至今仍未完全闡明[1]?！斗蔷凭灾拘愿尾≈嗅t(yī)診療專(zhuān)家共識(shí)意見(jiàn)(2017)》[2]中將此病分為5型，其中證型分布以肝郁脾虛證最為常見(jiàn)[3]。有研究表明脂質(zhì)沉積[4]、氧化應(yīng)激[5]、炎癥因子釋放[6]均可導(dǎo)致肝硬化和肝損傷，也是NAFLD的重要病理發(fā)展過(guò)程。故本研究從氧化應(yīng)激及炎癥因子的角度，探討柴苓術(shù)芍飲對(duì)肝郁脾虛型NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠35只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。于中科賽恩斯生物技術(shù)公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，使用許可證編號(hào)為SYXK(黑)2016-008。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～65%；每天更換墊料，提供充足的水和基礎(chǔ)飼料(中糧出品)。

1.2 高脂高膽固醇飼料 鈷-60輻照滅菌，其脂肪供能比37%、蔗糖20%、豬油15%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 藥物 柴苓術(shù)芍飲購(gòu)自黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院南崗分院，其主要成分為柴胡、當(dāng)歸、芍藥、白術(shù)、茯苓、炙甘草、煨生姜、薄荷，澤蘭、決明子、丹參、山楂、垂盆草、五味子，由黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院南崗分院制劑室進(jìn)行煎制，生藥濃度為6.58 g/mL。

1.4 主要試劑及儀器 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：美康生物科技股份有限公司；丙二醛(MDA)試劑盒：南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)試劑盒：武漢默沙克生物科技有限公司；GAPDH試劑：Abcam公司；羊抗兔IgG抗體：Millipore公司；TNF-α(WB法)和IL-1β(WB法)：ABclonal公司；飛克特超敏ECL發(fā)光液：Meilunbio。酶標(biāo)儀：深圳雷杜RT2100C；全自動(dòng)生化分析儀：日立LST008AS；5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)：Tanon；EPS600電泳儀：Tanon。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型制備及給藥 將35只SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常組，模型組，柴苓術(shù)芍飲高、中、低劑量組，每組7只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，除正常組外，模型組及柴苓術(shù)芍飲高、中、低劑量組用高脂高膽固醇飼料+饑飽失常法+夾尾刺激法[7]復(fù)制肝郁脾虛型NAFLD大鼠模型。夾尾刺激法為每天每只大鼠夾尾1次，時(shí)間為30 min；饑飽失常法為單日給予大鼠充足食物及水，雙日禁食不禁水，喂養(yǎng)8周。按照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人與大鼠按體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)0. 018(大鼠等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍)計(jì)算給藥劑量，柴苓術(shù)芍飲高、中、低劑量分別予25.2 g/kg、18.90 g/kg、12.6 g/kg劑量予大鼠灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃4 周。正常組大鼠灌胃給予同體積生理鹽水。用藥期間，各組大鼠繼續(xù)給予原有飼料喂養(yǎng)。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)

末次給藥后大鼠隔夜禁食，烏拉坦藥物麻醉后，取大鼠肝臟。準(zhǔn)確稱(chēng)取肝組織200 mg，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍體積的PBS，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清備用。

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)的檢測(cè) 其含量由全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

2.2.2 丙二醛(MDA)、肝組織腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3 腫瘤壞死因子(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)蛋白表達(dá) 采用Western Blot法進(jìn)行檢測(cè)。取20 mg肝組織，加入適量Complete RIPA buffer，冰上靜置20 min，加入RIPA預(yù)冷浸泡小鋼珠，冰凍研磨機(jī)震蕩1 min；冰上靜置30 min，渦旋震蕩20 s；4℃時(shí)13000 r/min離心10 min，取上清-80 ℃保存。取40 μg蛋白的溶液，經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、結(jié)合一抗、洗膜、結(jié)合二抗后，將膜浸于ECL發(fā)光液中，避光顯色2 min，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝組織SOD活性、MDA含量及TNF-α、IL-1β水平比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝組織MDA、SOD、TNF-α、IL-1β比較

3.2 各組大鼠肝組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖1及表2。與正常組相比，模型組肝組織IL-1β、TNF-α表達(dá)升高(P<0.01)；高、中劑量組IL-1β表達(dá)量下降(P<0.05)，且高劑量組下降最明顯(P<0.01)；高劑量組TNF-α表達(dá)量下降明顯(P<0.01)。

注：A.正常組；B.模型組；C.高劑量組；D.中劑量組；E.低劑量組；

表2 各組大鼠肝組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的比較

4 討論

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種復(fù)雜的、系統(tǒng)性的代謝疾病，有研究表明亞洲地區(qū)NAFLD的患病率達(dá)27.37%[8]，且隨著生活水平的提高，兒童NAFLD的整體患病率已接近10%[9]。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是包括肝臟脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化和肝硬化在內(nèi)的一系列代謝相關(guān)的肝臟病理綜合征[10]，除了脂肪變性，肝組織會(huì)出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)、肝細(xì)胞氣球樣變性，甚至伴有纖維化。研究表明，炎癥小體的激活在單純肝脂肪變性進(jìn)展為NASH的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]，炎癥小體的激活不僅促進(jìn)免疫細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，還可引發(fā)一種新的促炎性細(xì)胞死亡形式-細(xì)胞焦亡[12]。因此，腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素(IL-1β)等炎癥因子的檢測(cè)可用來(lái)判斷肝臟的損傷及其炎癥反應(yīng)程度。肝臟脂肪變性時(shí)，膽固醇(TC)及三酰甘油(TG)會(huì)有一定量的沉積，已有研究證明，SOD、MDA 與 TC、TG的沉積量有密切的關(guān)系[13]。SOD 是體內(nèi)一種重要的自由基清除劑，可以避免超氧陰離子自由基濃度過(guò)高時(shí)引起的不良反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物 MDA 可形成蛋白加合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的免疫損傷。臨床上常通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和減少細(xì)胞變性，進(jìn)而保護(hù)肝組織，治療非酒精性脂肪性肝病[14]。

至今，由于其治療靶點(diǎn)不夠精確，NAFLD的治療仍缺乏有效藥物。中醫(yī)藥治療NAFLD因有著顯著的療效和較低的副作用備受關(guān)注[15]。2017年，《非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療專(zhuān)家共識(shí)意見(jiàn)》中指出，肝郁脾虛型NAFLD的主方為逍遙散。逍遙散來(lái)自宋代《太平惠民和劑局方》，具有健脾、化濕、養(yǎng)血之功效。柴苓術(shù)芍飲是在逍遙散主方的基礎(chǔ)上增加了澤蘭、決明子、丹參、山楂、垂盆草、五味子；全方共奏健脾疏肝解郁之效。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠高脂高膽固醇飲食+饑飽失常造成脾胃損傷，夾尾令其活動(dòng)受限，造成情緒抑制、情志不遂而致肝郁，模擬了肝郁脾虛證的發(fā)病過(guò)程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用高劑量柴苓術(shù)芍飲灌胃治療后，大鼠肝組織勻漿中TNF-α、IL-1β、MDA水平降低，而SOD活性增高，證明肝郁脾虛型NAFLD大鼠肝臟組織的氧化應(yīng)激損傷減輕，相關(guān)炎癥因子的表達(dá)降低，說(shuō)明柴苓術(shù)芍飲對(duì)NAFLD大鼠的肝臟具有保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)肝臟組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α的蛋白表達(dá)量對(duì)比分析可以看出，模型組肝郁脾虛型NAFLD大鼠肝組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)高于正常組，說(shuō)明模型組炎癥因子釋放增加；而與模型組相比，各給藥組中的IL-1β、TNF-α的表達(dá)量有所降低，其中高劑量組差異最顯著(P<0.01)，提示柴苓術(shù)芍飲可能通過(guò)抑制炎癥因子釋放而達(dá)到治療作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝郁脾虛型NAFLD大鼠的干預(yù)。

綜上，柴苓術(shù)芍飲可以下調(diào)肝郁脾虛型NAFLD大鼠體內(nèi)IL-1β、TNF-α炎癥因子的表達(dá)，降低MDA水平，提高SOD的活性水平，為臨床上使用柴苓術(shù)芍飲治療肝郁脾虛型NAFLD提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。