李建香 劉云芳 王君君 顧 恒 趙 楊 過偉峰

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇南京 210022；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023）

腦出血是一種致死性腦血管病，急性期病死率高達(dá)35%~52%，幸存者常遺留明顯殘障[1]。研究表明，長期以來采用的止血、脫水、外科手術(shù)等方法未能明顯降低本病的致殘率和死亡率[2]。實(shí)踐證明，通腑瀉熱法治療中風(fēng)實(shí)證，可以開竅醒腦，減輕腦損傷[3]。前期研究證實(shí)，由國醫(yī)大師周仲瑛創(chuàng)制的涼血通瘀方，治療急性腦出血臨床療效顯著[4-6]。本方化裁自桃核承氣湯和犀角地黃湯，有通腑瀉下祛瘀之功，使氣血得以敷布，病情得有轉(zhuǎn)機(jī)，達(dá)到“上病下取”“從腸治腦”的目的。

前期研究發(fā)現(xiàn)，涼血通瘀方可以增加排便，改善腸道功能，調(diào)節(jié)腸-腦軸，影響腦腸肽[7]。八肽膽囊收縮素（cholecystokinin-8，CCK-8）作為一種典型腦腸肽，廣泛分布于胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是研究腸-腦軸的重要切入點(diǎn)?，F(xiàn)代研究證實(shí)，CCK-8是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，具有神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用，可促進(jìn)神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的合成，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)[8-9]。

課題組臨床研究發(fā)現(xiàn)，涼血通瘀方可通過提高神經(jīng)營養(yǎng)因子、減輕氧化應(yīng)激以改善腦出血患者癥狀和體征[6]。本研究以腦出血模型大鼠為研究對象，觀察給予涼血通瘀方干預(yù)后大鼠腦組織NGF、BDNF以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，以明確涼血通瘀方的神經(jīng)保護(hù)作用，通過檢測大鼠腦組織和腸組織CCK-8的含量以探討本方神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠，6~8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，光照黑暗交替，飼養(yǎng)室溫度20~25 ℃，濕度40%~60%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)通過南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查（批號：201805A026）。

1.2 藥物 涼血通瘀方（大黃10 g、水牛角30 g、生地黃20 g、赤芍15 g、牡丹皮10 g、石菖蒲10 g）中藥飲片由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院藥學(xué)部提供。水牛角先煎20 min，加入生地黃、赤芍、牡丹皮、石菖蒲，煮沸10 min，加入大黃再次煮沸10 min，倒出藥液，再加水煮沸10 min，過濾合并2次濾液，濃縮至1.2 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器 NGF抗體（批號：bs-0067R）、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（批號：C02-02001）、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（批號：bs-0295G）、DAPI（批號：C02-04002）、DAB試劑盒（批號：C02-04001）、蘇木素-伊紅染色試劑盒（批號：C02-04004）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BDNF抗體（批號：ab108319）、GAPDH抗 體（批 號：ab181602）、二 抗（批號：ab6722）購自Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010）、SOD試劑盒（批號：S0101）、MDA試劑盒（批號：S0130）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號：E12186R-1）購自南京奧青生物技術(shù)有限公司。

腦立體定位儀（加拿大David Kopf Instruments公司，型號：990-685），注射泵控制器（中國保定蘭格恒流泵有限公司，型號：TJ-1A），多功能開顱鉆（日本Makita公司，型號：6222D），生物顯微鏡（德國萊卡公司，型號：DM2500型），超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀（美國GE公司，型號：LAS4000mini），酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司，型號：EnSpire）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 采用改良自體血注入法制作腦出血大鼠模型[10]。麻醉動物，將其俯臥固定于腦立體定向儀，頭部正中切開，確定前囟點(diǎn)，選擇前囟點(diǎn)右側(cè)中線旁開3 mm、冠狀縫前0.2 mm處，定位尾狀核，顱骨鉆孔；反轉(zhuǎn)暴露尾根腹側(cè)，分離尾動脈，微量進(jìn)樣器刺入，抽取50 μL血液；微量進(jìn)樣器固定于立體定位儀，于鉆孔處緩慢進(jìn)針6 mm；以5 μL/min速度注入血液，注射結(jié)束采用二次退針法，骨蠟封閉顱孔。麻醉蘇醒后，使用Longa五級評分法對造模大鼠進(jìn)行評分，1~3分的動物為造模成功。

2.2 分組與給藥 SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、造模組。造模組按2.1項(xiàng)下方法造模，選取30只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、涼血通瘀方組，每組15只。假手術(shù)組大鼠處理方法同造模組，以微量進(jìn)樣器空針置入尾狀核，不注射血液，選術(shù)后存活的大鼠15只入組。正常組亦取15只入組。涼血通瘀方組以15 g/kg給予涼血通瘀方煎劑灌胃，正常組、假手術(shù)組、模型組灌胃等量生理鹽水，根據(jù)前期給藥后1 d、3 d、5 d三個時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]，本研究各組均每日灌胃1次，連續(xù)3 d。涼血通瘀方劑量根據(jù)人體和動物的等效劑量進(jìn)行換算。既往研究采用涼血通瘀方高、中、低劑量分別給藥，發(fā)現(xiàn)中劑量對急性腦出血動物腦功能改善效果最好[11]，因此本研究選擇15 g/kg劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 標(biāo)本采集與處理 末次給藥后，模型組、涼血通瘀方組大鼠采用Longa五級評分法評價(jià)神經(jīng)功能缺損程度。評分完成后，各組隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后開胸，暴露心臟，心內(nèi)依次灌注生理鹽水、4%多聚甲醛，取出血灶邊緣腦組織，石蠟包埋，用于檢測腦組織NGF表達(dá)。各組剩余10只大鼠處死后取出血灶邊緣腦組織和回盲部腸組織，-80 ℃保存，其中隨機(jī)取5只大鼠腦組織進(jìn)行BDNF蛋白檢測，取全部10只大鼠腦組織進(jìn)行SOD、MDA含量檢測，取全部10只大鼠腦組織和腸組織進(jìn)行CCK-8含量檢測。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 Longa五級評分法評價(jià)神經(jīng)功能缺損程度 分別于造模成功后、灌胃3 d后對模型組與涼血通瘀方組進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評價(jià)。采用Longa五級評分法，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無體征；1分，不能完全伸直前肢；2分，一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象；3分，不能站立或者打滾；4分，無自發(fā)性活動，有意識障礙。由統(tǒng)一培訓(xùn)的研究人員對大鼠進(jìn)行評分，每只動物重復(fù)評價(jià)3次，每次間隔1 min，取平均值。

2.4.2 免疫組化法檢測腦組織NGF表達(dá) 取各組5只大鼠腦組織石蠟切片，脫蠟脫水，抗原修復(fù)，血清封閉，一抗、二抗孵育，顯色，顯微鏡下觀察，適時(shí)終止；蘇木素復(fù)染，脫水，封片；生物顯微鏡觀察（×400），以胞漿或胞核棕黃色顆粒為陽性染色。選取血腫周圍腦組織3個視野。應(yīng)用Image pro plus 6.0軟件分析圖像，得到累積光密度值（IOD）和像素面積（Area），以IOD/Area值為平均光密度值。

2.4.3 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測腦組織BDNF蛋白表達(dá) 取各組5只大鼠腦組織，加入蛋白裂解液，球磨儀勻漿。充分裂解后，4 ℃離心（離心半徑10 cm，14 000 r/min，5 min）2次，取上清。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書配置，測吸光值，計(jì)算樣本蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法以25 V轉(zhuǎn)膜20 min，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉，室溫慢搖2 h。5%脫脂奶粉配制一抗，抗體濃度為1∶1000，置入一抗，4 ℃過夜，配制二抗，濃度為1∶5000，室溫震蕩孵育2 h，吸棄二抗稀釋液，TBST洗膜3次，每次5 min。根據(jù)說明書配制顯影液6 mL，置入化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)曝光。所得圖像經(jīng)Image J處理，檢測各組圖像灰度值。

2.4.4 生化法檢測腦組織SOD、MDA含量 取各組10只大鼠腦組織，加入裂解液研磨成勻漿，4 ℃離心（離心半徑10 cm，3000 r/min，10 min），取上清液。采用WST-8法檢測SOD含量，按照說明書配制SOD檢測緩沖液、WST-8/酶工作液和反應(yīng)啟動工作液，于96孔板加樣顯色，記錄酶標(biāo)儀上吸光度值；采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法檢測MDA含量，按照說明書配制MDA檢測工作液和標(biāo)準(zhǔn)品，于96孔板加樣顯色，記錄酶標(biāo)儀上吸光度值。

2.4.5 ELISA法檢測腦組織和腸組織CCK-8含量 取各組10只大鼠腦組織和腸組織，加入裂解液RIPA（每100 mg組織中加入1 mL RIPA），研磨勻漿，4 ℃離心（離心半徑10 cm，3000 r/min，10 min），取上清液，參照說明書操作，酶標(biāo)儀上測吸光度，計(jì)算濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（x-±s）表示。兩組間比較采用 t 檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，方差齊采用LSD法進(jìn)行多重比較，方差不齊采用Dunnett’s T3法進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 模型組與涼血通瘀方組大鼠Longa評分比較 模型組和涼血通瘀方組大鼠造模成功后Longa評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2組大鼠灌胃3 d后Longa評分均顯著低于造模成功后（P＜0.01）；灌胃3 d后，涼血通瘀方組Longa評分顯著低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 模型組與涼血通瘀方組大鼠造模成功后、灌胃3 d后Longa評分比較（x-±s） 單位：分

3.2 各組大鼠腦組織NGF表達(dá)比較 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織NGF平均光密度值顯著降低（P＜0.01），涼血通瘀方組平均光密度值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織NGF平均光密度值顯著升高（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織NGF表達(dá)（×400）

表2 各組大鼠腦組織NGF平均光密度值比較（x-±s）

3.3 各組大鼠腦組織BDNF蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，假手術(shù)組和模型組大鼠腦組織BDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），涼血通瘀方組表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與假手術(shù)組和模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腦組織BDNF蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠腦組織BDNF蛋白表達(dá)水平比較（x-±s）

3.4 各組大鼠腦組織SOD和MDA含量比較 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD含量顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；涼血通瘀方組大鼠腦組織SOD、MDA含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織SOD含量顯著升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠腦組織SOD和MDA含量比較（x-±s） 單位：μmol/L

3.5 各組大鼠腦組織和腸組織CCK-8含量比較 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織、腸組織CCK-8含量均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），涼血通瘀方組含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織、腸組織CCK-8含量均顯著升高（P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠腦組織和腸組織CCK-8含量比較（x-±s） 單位：pg/mL

4 討論

腦出血屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，顱內(nèi)血腫形成后繼發(fā)腦水腫、腦組織受壓甚至腦疝等，導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆損傷，患者常遺留明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀。如何保護(hù)急性腦出血受損周邊組織、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)是亟待解決的問題。目前相關(guān)神經(jīng)保護(hù)劑尚未受到廣泛認(rèn)可，需要進(jìn)行高質(zhì)量、大樣本的隨機(jī)對照試驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí)[12，2]。

通腑瀉熱法治療中風(fēng)始于金元，后世廣泛應(yīng)用。通腑瀉熱，“釜底抽薪”，腑氣暢通，往往神明清爽，病情逆轉(zhuǎn)。急性腦出血常合并陽明腑實(shí)證，風(fēng)火痰瘀內(nèi)結(jié)，氣機(jī)逆亂，通降失司，積滯內(nèi)停；腸腑濁氣壅塞，火升陽亢，上擾清明?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后中樞神經(jīng)受損，自主神經(jīng)功能紊亂，胃腸蠕動緩慢，長期臥床、脫水治療，加重腸道缺水；胃腸毒素蓄積，透過腸黏膜屏障，進(jìn)入血液；胃腸運(yùn)動遲緩可增加腹壓，加重顱內(nèi)壓升高[13]。通腑瀉熱以開竅醒腦，體現(xiàn)了“腦病治腸”的治療學(xué)理念。

國醫(yī)大師周仲瑛根據(jù)多年臨證經(jīng)驗(yàn)提出，對于急性中風(fēng)邪實(shí)證，臨床可應(yīng)用涼血通瘀法，以下為度，達(dá)到“上病下取”“從腸治腦”的目的。涼血通瘀方具有涼血散瘀、通腑瀉熱之功效。方中大黃通腑瀉熱、逐瘀祛邪，水牛角清熱瀉火、涼血寧血，二者合用阻斷血熱煎熬成瘀，防止瘀熱生風(fēng)化痰；生地黃滋陰養(yǎng)血、涼血清熱；赤芍、牡丹皮涼血散瘀；石菖蒲走竄上行，直達(dá)巔頂。

本研究采用改良自體血注入法制作腦出血大鼠模型，造模效果穩(wěn)定。前期研究表明，假手術(shù)組會出現(xiàn)因手術(shù)造成的腦組織輕微損傷，與正常組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定程度的差異，故本研究同時(shí)設(shè)立正常組和假手術(shù)組以幫助驗(yàn)證手術(shù)操作是否會引發(fā)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異。結(jié)果表明，與正常組比較，假手術(shù)組大鼠腦組織NGF表達(dá)和SOD、MDA含量，腦、腸組織CCK-8含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），腦組織BDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

本研究觀察了涼血通瘀方對急性腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并探索其機(jī)制。NGF和BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元生長分化發(fā)揮關(guān)鍵作用，與腦卒中密切相關(guān)，可保護(hù)受損神經(jīng)元[14-15]。NGF可促進(jìn)腦出血后軸突再生，激活血腫灶周圍神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)周圍組織新生血管形成[16]。BDNF能減輕腦出血神經(jīng)元受損死亡，促進(jìn)神經(jīng)元分化生長和卒中后的運(yùn)動、感覺康復(fù)[17]。本研究結(jié)果表明，涼血通瘀方可顯著升高急性腦出血模型大鼠腦組織NGF和BDNF蛋白表達(dá)，表明本方可促進(jìn)神經(jīng)元的激活，具有神經(jīng)保護(hù)作用。氧自由基導(dǎo)致腦出血后腦損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。SOD主要防御超氧陰離子自由基的強(qiáng)氧化，對抗氧自由基損傷。急性腦出血后周圍組織水腫缺血缺氧、繼發(fā)性顱內(nèi)壓增高、腦組織代謝紊亂等，催化產(chǎn)生大量氧自由基，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA，破壞細(xì)胞膜的生物結(jié)構(gòu)[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)涼血通瘀方可升高急性腦出血模型大鼠腦組織SOD含量，降低MDA含量，減輕腦出血后氧化應(yīng)激。

現(xiàn)代腸-腦軸理論的提出、腦腸互動學(xué)說的發(fā)展為研究腦腸相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)。腦腸肽是腦腸共有激素，可調(diào)節(jié)腦腸互動，CCK-8以神經(jīng)遞質(zhì)形式參與腦出血的發(fā)生發(fā)展[20]，具有神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，CCK-8可促進(jìn)NGF合成釋放，重建受損神經(jīng)元，協(xié)助軸突生長，參與神經(jīng)元存活再生；改善神經(jīng)生長微環(huán)境，拮抗神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)；同時(shí)提升SOD活力，降低MDA濃度，提高清除氧自由基的能力[21-23]。本研究結(jié)果表明，涼血通瘀方可顯著升高急性腦出血模型大鼠腦、腸組織CCK-8含量，這一作用可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上所述，涼血通瘀方對急性腦出血模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加腦、腸組織CCK-8的含量有關(guān)。未來可進(jìn)一步研究本方調(diào)節(jié)腸道動力功能或腸道微生物變化的作用機(jī)制，以及通過迷走神經(jīng)中樞途徑和腸-肝循環(huán)外周途徑影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制。