魏嘉億， 張 欽， 李樂謙， 黃小夏， 劉轉華， 孫毛毛，包俊穎， 陳紅宇， 郭曉華， 黃巧冰△

（1南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，廣東省醫(yī)學休克微循環(huán)重點實驗室，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510515）

膿毒癥（sepsis）是一種對感染的免疫反應失調、導致器官功能障礙的嚴重疾病，相關死亡率為15%~20%［1］。雖然現(xiàn)代重癥監(jiān)護的引入已經極大地提高了存活率，但依舊沒有針對膿毒癥的特效藥。肝臟因為參與炎癥產物（特別是腸源性的細菌和內毒素）的清除，成為膿毒癥中最易受損的器官之一，其結構、功能和代謝的變化對膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有重大影響［2］。鐵死亡是依賴于鐵的脂質過氧化和活性氧堆積導致的細胞死亡［3］，已有研究表明小鼠膿毒癥肝損傷過程中有鐵死亡的參與［4］，但發(fā)生機制尚未明了。

蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）是一種異硫氰酸鹽，衍生于硫代葡萄糖苷，在蕓薹屬植物中含量豐富。已有研究證明SFN 具有抗氧化、抗炎和抑制癌細胞的作用，并在膿毒癥動物模型中對心肌有保護效應，改善腎和肺功能［5-10］，但SFN 是否對膿毒癥肝損傷有抑制作用尚不清楚。SFN是核因子E2相關因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的激動劑，研究已表明Nrf2 既能通過調節(jié)胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白xCT和谷胱甘肽過氧化物酶4抑制鐵死亡［11］，也可通過阻斷促炎細胞因子的轉錄而抑制巨噬細胞的炎癥反應［12］；而炎癥細胞因子白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）可促進肝臟鐵調素（hepcidin）基因HAMP（hepcidin antimicrobial peptide）的轉錄［13］。鐵調素可內化降解肝細胞膜的鐵輸出蛋白1（ferroportin 1，F(xiàn)PN1），使鐵無法轉運出肝細胞，可能導致肝細胞鐵超載［14］。因此，本研究假設SFN 可能通過激活巨噬細胞的Nrf2，減少IL-6 的生成，抑制肝鐵調素的轉錄激活，從而促進肝細胞的鐵轉運，減輕鐵超載和鐵死亡。本項工作通過建立膿毒癥肝損傷的小鼠模型，探討SFN 對膿毒癥小鼠肝臟鐵死亡的抑制作用及其可能機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級C57BL/6 小鼠，7~10 周齡，雄性，體重20~25 g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證：SCXK（粵）2016-0041。飼養(yǎng)在恒溫24 ℃，相對濕度40%~70%，光照周期12 h/12 h 環(huán)境中，動物實驗前12 h禁食。

1.2 試劑 SFN 和去鐵胺（deferoxamine，DFO）購自MedChemExpress；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒購自中國貝博公司；IL-6 ELISA 試劑盒購自中國武漢華美公司；鐵調素ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；RNA 提取試劑購自中國捷倍斯生物公司；逆轉錄試劑盒購自南京諾唯贊公司；熒光定量PCR 試劑購自東盛生物公司；PCR 引物購自上海生工生物工程有限公司；抗Nrf2和FPN1抗體購自愛博泰克生物公司。

2 實驗方法

2.1 構建動物模型 通過盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）構建膿毒癥小鼠模型［15］。小鼠在術前12 h禁食，用劑量為10 mg/kg·bw 的10%水合氯醛麻醉。麻醉后行小鼠腹部去毛、消毒，沿腹中線切口取出盲腸，3 號手術線結扎，21G 針穿孔，擠出糞便，將盲腸復位，逐層縫合腹壁肌肉和皮膚。假手術組只取出盲腸不結扎不穿孔，其余步驟同CLP組。

2.2 實驗分組和給藥 將小鼠隨機分成4組：假手術（sham）組、CLP組、CLP+SFN組和CLP+DFO組，每組4只。SFN和DFO分別溶于生理鹽水中，CLP+SFN組在術后立即腹腔注射0.5 mg/kg 的SFN，CLP+DFO組在術后立即腹腔注射100 mg/kg 的DFO，sham組和CLP組給予等體積的生理鹽水。觀察12 h 后，取血制備血清，并取肝組織，用預冷的PBS 洗滌后，置于-80 ℃保存，后續(xù)進行相關指標的檢測。

2.3 肝功能指標檢測 按照ALT 和AST 試劑盒說明書，取 5 μL 的小鼠血清和標準品，與 25 μL 試劑 I混勻，37 ℃反應30 min；再加入25μL試劑Ⅱ，混勻后37 ℃反應20 min；最后加入240μL試劑Ⅲ，室溫放置10 min 后，505 nm 波長處測得血清和標準品的吸光度。根據(jù)標準品的吸光度計算小鼠血清中ALT 和AST活性。

2.4 ELISA 檢測血清中IL-6 和鐵調素水平 按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中IL-6 和鐵調素水平。取50 μL 的小鼠血清，樣品稀釋液定容至100μL。血清樣品和標準品液各取100μL 到酶標板中，覆膜，37℃孵育90 min；甩盡液體，加入生物素化抗體工作液100 μL，覆膜，37 ℃孵育60 min；甩盡液體，洗滌后加入酶結合物工作液100 μL，覆膜，37 ℃孵育30 min；甩盡液體，洗滌后加入底物溶液，37 ℃避光30 min，加入終止液后，450 nm 波長處測得血清和標準品的吸光度。根據(jù)標準品的吸光度得到小鼠血清中IL-6和鐵調素含量。

2.5 化學比色法檢測肝組織勻漿中NADPH 和MDA 含量 按照NADPH 和MDA 試劑盒說明書操作，檢測肝組織勻漿中NADPH 和MDA 含量。50 mg肝組織勻漿 12 000×g離心 10 min 后取上清。50 μL的上清和NADPH 標準品液各加入100μL 的G6PDH工作液，37 ℃避光孵育 10 min 后，加入 10 μL 顯色液，混勻，37 ℃避光孵育20 min，在450 nm 波長處測得吸光度，根據(jù)吸光度計算肝組織中NADPH 含量。100 μL 的上清和MDA 標準品工作液中各加入200μL的MDA 檢測工作液，混勻后100℃加熱15 min；水浴冷卻至室溫，1 000×g室溫離心10 min；取200 μL上清至96 孔板中，532 nm 波長處測得吸光度，根據(jù)吸光度計算MDA含量。

2.6 肝組織RNA 提取與RT-qPCR 用TRIzol 提取肝組織總RNA。1 μg 總RNA 用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。引物序列如下：GAPDH 的上游引物序列為5＇-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3＇，下游引物序 列 為 5＇-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3＇；前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）的上游引物序列為5＇-CTGCGCCTTTTCAAGGATGG-3＇，下 游 引 物 序 列 為 5＇-GGGGATACACCTCTCCACCA-3＇；HAMP 的上游引物序列為 5＇-GCACTCAGCACTCGGACC-3＇，下游引物序列為 5＇-CACACTGGGAATTGTTACAGC-3＇；IL-6 的上游引物序列為5＇-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3＇，下游引物序列為5＇-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3＇。擴增程序為：預變性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)；熔解曲線 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。用 2-ΔΔCt法來計算 PTGS2、HAMP 和 IL-6的mRNA相對定量。

2.7 酸消化法檢測肝組織中的非血紅素鐵 依據(jù)文獻［16］，取肝臟左外葉的肝組織100 mg，用三氯乙酸+鹽酸（10%三氯乙酸在3 mol/L鹽酸中）消化48 h，溫度65 ℃~70 ℃。等體積樣品或鐵標準（5 mg/L）在200 μl BAT 緩沖液（0.2%巰基乙酸和0.02%4，7-二苯基-1，10-菲咯啉二磺酸鈉在50%飽和醋酸鈉溶液中）室溫下孵育10 min。535 nm 處測得樣品孔和標準品孔吸光度，根據(jù)標準品孔吸光度計算樣品孔非血紅素鐵含量。

2.8 Western blot 檢測蛋白表達 取肝組織勻漿或RAW264.7 細胞裂解液，離心取上清，BCA 法測濃度，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，抗FPN1 抗體（1∶800）和抗Nrf2 抗體（1∶1 000）孵育過夜，次日孵育Ⅱ抗后洗膜，超敏發(fā)光試劑顯影。

2.9 HE染色觀察肝組織 CLP術后12 h，取小鼠肝臟組織，用4%多聚甲醛固定后脫水、石蠟包埋并切片，脫蠟、水化后使用HE染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學改變。

2.10 透射電子顯微鏡觀察肝組織 CLP術后12 h，取1 mm×1 mm×1 mm 小鼠肝臟組織浸泡在2.5%戊二醛中，經常規(guī)脫水、滲透、包埋、切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在透射電鏡下觀察肝組織線粒體形態(tài)變化。

2.11 細胞培養(yǎng)和分組 將RAW264.7 細胞以每皿3×106個接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)液，于 37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩日換液，根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，當每皿細胞數(shù)約9×106個時傳代。將傳代后的細胞分為3組，正常對照（control，Ctrl）組僅加入等量的完全培養(yǎng)基；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激組用含終濃度 1 mg/L 的 LPS 培養(yǎng)液干預 4 h；LPS 和 SFN 共同刺激（LPS+SFN）組用含有終濃度1 mg/L 的LPS 和50μmol/L 的SFN 培養(yǎng)液干預4 h。4 h 后提取細胞蛋白或者固定細胞。

2.12 免疫熒光觀察細胞內Nrf2 蛋白定位 細胞用PBS 洗3 遍，經4%多聚甲醛固定，0.1%Triton X-100通透，2%牛血清白蛋白封閉，抗Nrf2 抗體（1∶500）孵育過夜，次日孵育Ⅱ抗，DAPI 染色，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內Nrf2熒光信號。

3 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 8.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SFN對CLP小鼠肝功能和肝臟組織形態(tài)的影響

與 sham組相比，CLP組小鼠血清 ALT 和 AST 水平顯著升高（P＜0.05），肝組織中肝索結構欠清晰，肝竇狹窄，炎癥細胞浸潤明顯；而與CLP組相比，CLP+SFN組血清ALT 和 AST 水平顯著降低（P＜0.05），肝組織中肝索結構恢復，炎癥細胞浸潤減少，見圖1。

Figure 1. Effect of sulforaphane on hepatic function and morphology. A：serum ALT and AST activity；B：HE staining of liver tissue（scale bar=50 μm；yellow arrow：infiltrated inflammatory cells）. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CLP group.圖1 蘿卜硫素對肝功能和肝組織形態(tài)學的影響

2 SFN對CLP小鼠肝組織鐵代謝的影響

與sham組相比，CLP組小鼠肝組織中HAMP mRNA 水平顯著升高，F(xiàn)PN1 蛋白表達顯著減少，血清中鐵調素蛋白水平顯著升高，非血紅素鐵顯著增多（P＜0.05）；而與CLP組相比，CLP+SFN組肝組織中HAMP mRNA 水平顯著下降，F(xiàn)PN1 蛋白表達顯著增加，血清鐵調素水平顯著降低，非血紅素鐵含量顯著減少（P＜0.05），見圖2。

3 SFN對CLP誘導的肝組織鐵死亡的影響

與sham組相比，CLP組小鼠肝組織中NADPH 和MDA 含量顯著增加，PTGS2 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05），線粒體形態(tài)縮小，嵴消失；給予鐵死亡抑制劑 DFO 后（CLP+DFO組），肝組織中 NADPH 和MDA 含量及PTGS2 mRNA 水平均顯著降低（P＜0.05），線粒體形態(tài)恢復；CLP+SFN組與 CLP組相比，NADPH 和 MDA 含量及 PTGS2 mRNA 水平也顯著降低（P＜0.05），而與CLP+DFO組相比則無顯著差異（P＞0.05），線粒體大小和嵴結構恢復，見圖3。

4 SFN對Nrf2和IL-6的影響

與Ctrl組相比，給予LPS 刺激后RAW264.7細胞的胞質和胞核中Nrf2 蛋白表達均降低，定位胞核的Nrf2 顯著減少；而在LPS 刺激時同時給予SFN，胞質和胞核中Nrf2 蛋白表達均顯著增加，以胞核Nrf2 蛋白表達的增加尤為顯著，定位胞核的Nrf2 也顯著恢復，見圖4。與sham組相比，CLP組小鼠肝組織Nrf2蛋白表達有減少趨勢，而肝組織IL-6 mRNA 和血清IL-6水平升高（P＜0.05）；給予SFN 后，CLP+SFN組小鼠肝組織IL-6 mRNA 和血清IL-6 水平顯著降低，見圖5。

Figure 2. Effect of sulforaphane（SFN）on iron metabolism in liver tissue. A：the level of HAMP mRNA in liver tissue；B：the content of serum hepcidin；C：the expression of FPN1 protein in liver tissue；D：non-heme iron content in liver tissue. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 v s CLP group.圖2 蘿卜硫素對肝組織鐵代謝的影響

Figure 3. Effects of sulforaphane（SFN）on ferroptosis. A：NADPH content；B：MDA content；C：the level of PTGS2 mRNA；D：morphological changes of mitochondria（scale bar=500 nm；black arrow：the shrinkage of mitochondria；yellow arrow：the disappearance of mitochondrial cristae）. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CLP group.圖3 蘿卜硫素對鐵死亡的影響

Figure 4. Effects of sulforaphane（SFN）on Nrf2 expression and location in RAW264.7 cells. A：the level of Nrf2 protein expression in cytoplasm and nucleus；B：immunofluorescence of Nrf2 protein in RAW264.7 cells（scale bar=10 μm）. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control（Ctrl）group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 蘿卜硫素對巨噬細胞Nrf2表達和細胞定位的影響

Figure 5. Effects of sulforaphane（SFN）on Nrf2 and IL-6 expression in CLP mice. A：the level of Nrf2 protein in liver tissue；B：the level of IL-6 mRNA in liver tissue；C：the serum IL-6 content. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CLP group.圖5 蘿卜硫素對肝組織Nrf2蛋白和IL-6 mRNA水平及血清IL-6含量的影響

討 論

本研究使用經典的CLP 方法制備小鼠的膿毒癥模型，在證實CLP 可介導肝損傷并導致肝組織發(fā)生鐵死亡的前提下，證明Nrf2 激動劑SFN 減輕CLP 小鼠肝組織的鐵死亡。這一過程伴隨有IL-6 含量的減少和鐵調素mRNA 及蛋白水平的降低。本研究還證明SFN可增加巨噬細胞Nrf2的表達和核定位。

肝臟是膿毒癥發(fā)生過程中較早且易被損傷的靶器官［17］。本研究結果顯示小鼠CLP組肝組織有明顯的炎癥細胞浸潤，血清ALT 和AST 水平升高，證實小鼠CLP術后12 h即可出現(xiàn)肝結構和功能損傷。

研究揭示膿毒癥與鐵代謝失調有關系［18］，膿毒癥時由于紅細胞破壞等因素使肝細胞鐵來源增多，而IL-6 的釋放又促進肝細胞分泌的鐵調素合成增加，導致跨膜的鐵輸出蛋白FPN 內化、降解，使肝細胞鐵輸出減少，共同導致肝細胞鐵的蓄積［14，19-21］。本研究顯示CLP 小鼠肝臟組織中非血紅素鐵水平異常升高，證實了肝細胞中出現(xiàn)了鐵的蓄積和超載，并伴隨肝組織IL-6、HAMP mRNA 及鐵調素水平升高，F(xiàn)PN1 蛋白表達降低，提示CLP 小鼠肝細胞的鐵超載也與IL-6/鐵調素/FPN1信號通路的變化有關。

細胞鐵超載通過芬頓反應促進脂質過氧化物反應，導致細胞發(fā)生鐵死亡［22］。Wei等［4］的研究證明了膿毒癥時鐵死亡參與了小鼠肝損傷的發(fā)生。本研究中，CLP 小鼠肝組 織中鐵死 亡 的各項指 標［23］如NADPH 和 MDA 含量 及 PTGS2 mRNA 水平等均 增加，肝細胞線粒體皺縮和嵴減少，證明此時小鼠確實發(fā)生了肝細胞的鐵死亡。

Nrf2 是鐵死亡中的一種負調節(jié)因子［24］。姚鵬等［25］的研究顯示，Nrf2 與大鼠膿毒癥相關性腦病中海馬神經細胞的鐵死亡有關，膿毒癥大鼠中的Nrf2蛋白量比正常組減少。在細胞和動物水平的研究顯示，Nrf2 可抑制 IL-6 和 IL-1β 的轉錄［12］。本研究結果顯示，LPS 刺激的巨噬細胞胞質和胞核的Nrf2 含量均降低，核定位明顯減少，可能是導致IL-6 含量增多的原因之一；而激活Nrf2 可通過抑制IL-6 介導的鐵調素激活，從而減輕鐵死亡。

SFN 是一種從十字花科植物中提取出來的有機硫化合物，具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化作用。已有研究證明在不同類型的膿毒癥動物模型制備之前、立即以及術后給予SFN，對神經、心、肺和腎功能都有不同程度的保護作用，且能提高存活率［7，8，10，26］。已有研究提示SFN 可作為激動劑上調Nrf2 的表達［27］。本研究首次證明，CLP 模型制備后立即給予0.5 mg/kg 的 SFN［8］可顯著增加被 LPS 下調的巨噬細胞 Nrf2的蛋白含量，恢復并增加其核定位；也能降低CLP 小鼠血清IL-6 水平，使肝組織HAMP基因的轉錄減少，鐵調素含量降低，F(xiàn)PN1 蛋白表達增加，小鼠肝組織的鐵超載和鐵死亡被部分抑制，肝功能指標有改善。這些結果提示SFN 可以通過上調Nrf2 而改善CLP 誘導的小鼠肝組織鐵代謝，并保護肝功能。值得注意的是，本研究CLP 小鼠肝組織總的Nrf2 含量降低并不顯著，除了組織中包含多種細胞等影響，也提示此時IL-6 的增多還有其它的激活因素。但給予Nrf2 激動劑SFN 后，IL-6 的mRNA 和蛋白水平均明顯降低，說明激活Nrf2 對IL-6 具有明顯的抑制作用，并因此而減輕肝細胞鐵死亡。

綜上所述，本研究的結果初步證明，Nrf2 激活劑SFN 可減輕CLP 引起的小鼠肝組織鐵死亡，保護肝功能；其作用機制可能是通過降低CLP 小鼠IL-6 的含量，抑制鐵調素的作用，促進肝細胞鐵轉運。本研究為臨床膿毒癥肝損傷的防治提供了參考資料。