王偉，于亮，王志，王偉偉，鈕力亞，陸莉，王奉芝，張景儉

(滄州市農(nóng)林科學院/河北省農(nóng)作物耐鹽堿評價與遺傳改良重點實驗室，河北 滄州 061001)

土壤鹽漬化是當前世界上最難解決的資源環(huán)境問題之一[1]，而干旱半干旱地區(qū)的土壤鹽堿化日益嚴重[2-3]。鹽漬化土壤在世界范圍內(nèi)分布廣泛，世界各地鹽堿化的土壤總面積高達8.31×109hm2，我國鹽漬化的土壤面積近1 億hm2，其中河北省鹽堿地總面積約71.61 萬hm2，約占耕地總面積的10%。其中，滄州市是河北省乃至全國濱海鹽堿地集中的主要地區(qū)之一[4-6]。研究、開發(fā)和利用鹽漬化土壤對保護耕地資源、保障國家糧食安全具有重要的現(xiàn)實意義。

培育耐鹽堿植物新品種和提高植物耐鹽堿能力是鹽堿地生物改良的有效途徑。篩選和鑒定耐鹽堿種質(zhì)資源是培育耐鹽堿植物新品種的重要基礎。植物種類不同，耐鹽堿能力的鑒定方法也不同。即使同一植物種類，不同研究人員采用的鑒定方法和標準也有所不同。目前主要有單鹽(NaCl)脅迫鑒定[7-8]、多種鹽分配比脅迫鑒定[9-10]和人工海水配方脅迫鑒定[11-12]等方法，且這些方法各有優(yōu)缺點。如人工海水配方脅迫鑒定方法雖然鹽分離子較為全面，但與實際自然環(huán)境下鹽堿地土壤離子組成仍有較大差異。生產(chǎn)上迫切需要一種可室內(nèi)操作、快速、高效的、貼近自然環(huán)境中鹽堿地鹽分離子實際的配方，以用于植物耐鹽堿鑒定與評價。

目前，關于土壤鹽分離子檢測的數(shù)據(jù)與分析均是基于樣本檢測的結果，受取樣時間、取樣地點、取樣土層等影響[13-14]，不能完全準確地反映取樣地區(qū)鹽分離子含量的總體情況。本研究基于滄州濱海鹽堿區(qū)的鹽分離子檢測數(shù)據(jù)，采用多變量重抽樣自舉法[15-16]，利用計算機模擬抽樣，綜合推斷滄州濱海鹽堿地主要鹽分離子的總體含量，然后依據(jù)陰陽離子電荷平衡，建立代表自然環(huán)境下輕度、中度、重度鹽堿地鹽分的化學試劑配方(簡稱人工鹽堿地配方)，并采用小麥芽期鹽堿耐性鑒定試驗驗證配方的科學性和有效性，以期為建立快速、高通量的室內(nèi)植物耐鹽堿鑒定與評價方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 土樣采集與檢測方法

于2019 年河北滄州地區(qū)的“返鹽”季節(jié)分別在濱海的鹽山、黃驊、中捷、海興4 地典型的鹽堿地上分3 個批次取樣。每次取樣時間間隔約40 d，分別為3 月21 日至3 月25 日、4 月1 日至4 月5 日、5月11 日至15 日。采用5 點取樣法，利用土鉆分別采取0～20、20～40、40～60、60～80、80～100 cm 5 個土層的土壤。鹽山設4 次重復，其他取樣地點設3次重復。采集完后立刻帶回實驗室自然陰干，然后將各土樣混合均勻后過篩，用于鹽分離子檢測。

采用電導法[17]測定土壤可溶性總鹽含量；用pH 計測定土樣pH 值；采用火焰分光光度計法測定鉀離子、鈉離子含量[18]。土樣進行相應前處理后，采用AA3 流動分析儀進行土壤總含鹽量及各主要鹽分離子含量的測定，包括碳酸根+碳酸氫根離子、鈉離子、鎂離子、氯離子、鈣離子、硅酸根和硫酸根離子。

1.2 多變量重抽樣自舉的實現(xiàn)方法

根據(jù)莫惠棟的重抽樣技術——自舉法[16]，綜合考慮各鹽分離子間的相互關系，實現(xiàn)各鹽分離子含量的重抽樣自舉。其主要步驟如下:

Step1:將195 個樣本編碼為1～195 號，共195組數(shù)據(jù)。

Step2:重抽樣自舉樣本。抽1～195 的隨機數(shù)字，將抽到樣本的所有指標的數(shù)據(jù)作為自舉樣本的一組觀察值。循環(huán)抽樣195 次(n=195)，獲得的195 組數(shù)據(jù)構成一個新的自舉樣本。

Step3:將新的自舉樣本按輕度、中度、重度鹽堿地的總含鹽量等級標準分類，獲得該樣本的輕度、中度和重度鹽堿地的其他各個指標的平均數(shù)。

Step4:重復第2 和第3 步，循環(huán)重抽樣10 000次，獲得10 000 個重抽樣自舉樣本的輕度、中度和重度鹽堿地(3 種類型)各指標的平均數(shù)。

Step5:計算10 000 個重抽樣自舉樣本各指標平均數(shù)的均值和標準誤。

1.3 試驗材料和小麥芽期耐鹽堿鑒定方法

選擇16 個常規(guī)小麥品種作為試驗材料(表1)，以超純水為對照，設置輕度、中度、重度3 個鹽分水平的鹽堿地配方，分別進行發(fā)芽試驗。在培養(yǎng)皿中放兩層濾紙，分別加入去離子水(對照)和鹽分溶液，每個處理30 粒種子，3 次重復。置于光照培養(yǎng)箱發(fā)芽(25 ℃恒溫，光照16 h)。7 d 后調(diào)查發(fā)芽率，隨機挑選10 株幼苗調(diào)查芽長、根長、根數(shù)、芽鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量及根冠比，并計算各性狀的相對值。計算公式為:性狀相對值=鹽堿脅迫下性狀值/對照條件下性狀值[19]。

表1 試驗采用的小麥品種和來源Table 1 Varieties and sources of the wheat cultivate used in the experiment

采用隸屬函數(shù)法，利用主成分分析和聚類分析進行小麥芽期鹽堿耐性評價[19-20]。根據(jù)各試驗材料各指標的相對值，采用主成分分析獲得各材料的因子得分后，通過隸屬函數(shù)法對各試驗材料因子得分進行分析，獲得衡量各材料鹽堿耐性強弱的D值，再采用K-均值聚類方法對各材料的D值進行聚類，將供試材料的鹽堿耐性分為髙耐、耐鹽、中耐、敏感、高感5 個級別。

2 結果與分析

2.1 人工模擬鹽堿地鹽分配方的建立

2.1.1 歸類和重抽樣自舉

按照輕度鹽堿地(總含鹽量小于0.3%)、中度鹽堿地(總含鹽量介于0.3%～0.6%之間)和重度鹽堿地(總含鹽量超過0.6%)分類標準對檢測數(shù)據(jù)進行分類，分別形成輕度、中度和重度鹽堿地各離子的樣本數(shù)據(jù)。再采用多變量自舉法，利用Python3.7.4實現(xiàn)重抽樣自舉，估計出輕度、中度和重度3 類濱海鹽堿地各鹽分離子總體的平均數(shù)和標準誤(表2)。最后，根據(jù)陰陽離子電荷平衡，組合形成輕度、中度、重度人工鹽堿地鹽分配方(表3)。

表2 基于重抽樣自舉法的各鹽分離子的參數(shù)估計Table 2 The parameter estimates of salt ions based on resampling bootstrap method

表3 人工模擬鹽堿地鹽分配方Table 3 The artificial simulated formula of the salts from the saline alkali soilg·L-1

2.1.2 人工模擬鹽堿地鹽分溶液的制備

取約800 mL 超純水，依次加入表3 中相應含量的各試劑，待充分溶解后，用容量瓶定容至1 000 mL，形成類似于自然環(huán)境條件下輕度、中度和重度濱海鹽堿地鹽分的溶液。應用中必須注意的是，該溶液長時間靜置容易產(chǎn)生少量沉淀，需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 人工模擬鹽堿地鹽分配方在小麥芽期耐鹽堿鑒定中的應用

2.2.1 小麥芽期耐鹽堿鑒定中鹽分水平的選擇

為了驗證本研究中的配方在植物鹽堿耐性鑒定中的可行性和有效性，需要采用F測驗進行方差分析。方差分析結果表明(表4)，除根鮮質(zhì)量外，對照與輕度、中度和重度鹽堿地的模擬配方在發(fā)芽率、芽長、根長、根數(shù)、芽鮮質(zhì)量和根冠比6 個指標上均存在極顯著差異(P＜0.01)。

表4 小麥芽期耐鹽堿鑒定指標的方差分析結果Table 4 The analysis of variance for the traits of wheat for the salt and alkali tolerance at germination stage

采用Duncan’s 新復極差法進行多重比較(表5)，根據(jù)多重比較結果確定小麥芽期鹽堿耐性鑒定的鹽分水平。

表5 處理間的多重比較結果Table 5 The multiple comparisons between the treatments

輕度鹽堿地模擬配方與對照在發(fā)芽率、根數(shù)、根冠比指標上均存在顯著或極顯著差異。中度和重度鹽堿地模擬配方與對照在發(fā)芽率、芽長、根長、根數(shù)和根冠比5 個指標上均存在顯著或極顯著差異，而中度和重度鹽堿地模擬配方僅在根數(shù)、根鮮質(zhì)量和根冠比上差異不顯著。根據(jù)表2 可知，輕度、中度和重度鹽堿地鹽分配方的總含鹽量平均值分別為1.149 1、3.832 1 和7.754 1 g/kg。根據(jù)小麥耐鹽堿鑒定時自然條件下田間鹽堿地的實際情況，結合趙松山等[5]在田間及模擬鹽池中關于小麥耐鹽性鑒定的經(jīng)驗，綜合確定實驗室內(nèi)進行小麥芽期鹽堿耐性鑒定時采用中度鹽堿地鹽分配方較為合適。

2.2.2 小麥芽期鹽堿耐性鑒定結果

以主成分分析獲得的3 個主成分因子作為鑒定小麥芽期鹽堿耐性的綜合指標，計算各綜合指標的隸屬函數(shù)值及權重，進而得到各材料芽期的鹽堿耐性綜合評價值(D)，D值越大，鹽堿耐性越強。采用K-均值聚類方法將供試材料的鹽堿耐性分為髙耐、耐鹽、中耐、敏感、高感5 個級別(表6)。鑒定結果:農(nóng)家種滄紅和茶淀紅的耐鹽堿等級為1 級(高耐)；滄麥6002、滄麥6005、冀麥32、科遺26、輪抗6 和輪抗7 的耐鹽堿等級為2 級(耐鹽)；濟麥22、石麥22、晉麥47 和山融3 號的耐鹽堿等級為3 級(中耐)；科農(nóng)9204 和中國春的耐鹽堿等級為4 級(敏感)；衡4399 和矮抗58 的耐鹽堿等級為5 級(高感)。

表6 小麥芽期鹽堿耐性鑒定結果Table 6 Identification of salt and alkali tolerance of wheat at germination stage

3 討論

3.1 關于重抽樣自舉法的應用

自舉法是現(xiàn)代統(tǒng)計學研究中的一種重抽樣技術，依賴于計算機的大容量和高效率進行相應統(tǒng)計數(shù)的估計[15-16]。因為土壤鹽分離子間存在這樣或那樣不同程度的相互關聯(lián)，如果利用樣本單個鹽分離子的檢測數(shù)據(jù)估計其總體的參數(shù)易出現(xiàn)誤差。本研究首次將自舉法應用到土壤離子成分的構成分析。在滄州濱海鹽堿地土樣檢測的樣本數(shù)據(jù)的基礎上，采用多變量重抽樣自舉法[16]和Python 語言，利用計算機模擬對樣本資料進行復置抽樣，產(chǎn)生一系列新的能夠代表被研究總體的多個樣本，進而模擬出統(tǒng)計數(shù)的分布，估計輕度、中度和重度鹽堿地上主要鹽分離子的總體參數(shù)。同時，根據(jù)陰陽離子電荷平衡，組配出貼近自然環(huán)境實際的輕度、中度和重度鹽堿地鹽分的化學試劑配方。

3.2 關于人工模擬鹽堿地鹽分配方的特點

本研究在滄州濱海鹽堿地主要鹽分離子檢測數(shù)據(jù)的基礎上，首先利用多變量重抽樣自舉法估計出各主要鹽分離子的總體含量，然后根據(jù)土壤中陰陽離子電荷平衡組配化學試劑，形成了人工模擬鹽堿地鹽分配方。這3 種模擬配方含有8 種鹽分離子，比NaCl 脅迫鑒定[7-8]、多種鹽分配比脅迫鑒定[9-10]和人工海水配方脅迫鑒定[11-12]中的鹽分離子更全面。而且通過重抽樣自舉法對配方中的離子含量實現(xiàn)參數(shù)估計，相當于采用大量的實際鹽分離子檢測數(shù)據(jù)，更貼近自然環(huán)境下濱海鹽堿地的實際鹽分含量。

3.3 關于人工模擬鹽堿地鹽分配方的應用

采用本研究中的人工模擬鹽堿地鹽分配方，可以在室內(nèi)快速實現(xiàn)植物鹽堿耐性的鑒定工作。小麥芽期鹽堿耐性鑒定試驗結果表明，中度鹽堿地的模擬配方適宜作為小麥芽期鹽堿耐性鑒定的鹽分水平。其中，滄紅和茶淀紅是較為耐鹽的農(nóng)家種，本研究鑒定的等級與田間實際相符；滄麥6002、滄麥6005、冀麥32 的耐鹽堿等級鑒定為耐鹽，與相關研究結果基本吻合[19，21]；中國春、科農(nóng)9204 和衡4399是常規(guī)意義上的不耐鹽堿小麥材料，在本研究中鑒定為敏感或高感。另外，晉麥47 和山融3 號在本研究中的鑒定等級與相關報道有一定差異[22]，可能是由于本研究目前僅限于小麥芽期鹽堿耐性的鑒定結果，如果對小麥全生育期的鹽堿耐性進行鑒定，也有可能與芽期的耐鹽鑒定結果不一致。綜上，采用本研究配方對小麥的芽期鹽堿耐性的鑒定結果與相關的實踐或文獻資料基本吻合，在一定程度上說明該配方的可行性和有效性。另外，在其他植物鹽堿耐性的鑒定上，此人工模擬鹽堿地鹽分配方的可行性和有效性則有待進一步探討。

4 結論

本研究結果表明，通過多變量重抽樣自舉法可以實現(xiàn)滄州濱海鹽堿地主要鹽分離子含量的參數(shù)估計。根據(jù)各離子參數(shù)估計的結果，結合陰陽離子電荷平衡，形成了人工模擬鹽堿地鹽分配方，并將其成功應用于室內(nèi)小麥芽期鹽堿耐性的鑒定與評價中，鹽堿耐性鑒定結果與小麥田間實際表現(xiàn)吻合。