段政勇，邢 志，王海崗，陳 凌，Dipak K Santra ，王瑞云，，喬治軍，

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031；3.內(nèi)布拉斯加大學林肯分校農(nóng)藝系小宗糧豆研究與推廣中心，美國 內(nèi)布拉斯加州 69361）

黍稷（Panicum miliaceumL.）屬于禾本科黍屬，又名糜黍、糜子。黍稷栽培歷史可以追溯到1萬年以前，是我國北方的主栽作物[1]，在歐亞大陸的許多干旱地區(qū)均有分布[2]。黍稷具有生長周期短、抗鹽抗旱、耐貧瘠的特性，蘊含著豐富的抗逆基因，一般在溫暖的季節(jié)生長、成熟、結實，并能夠充分利用水資源，是旱地半干旱地栽培的主要農(nóng)作物[3-4]。黍稷營養(yǎng)豐富，淀粉、高膳食纖維、蛋白質(zhì)以及多種維生素為其主要組成部分，對人體有著較高的營養(yǎng)價值，黍稷還含有豐富的礦質(zhì)元素、多酚、黃酮等，能夠降血糖、增強人體機制、預防多種疾病[5-7]。黍稷生態(tài)適應性強[8]，分布廣泛，種質(zhì)資源種類繁多，基因組信息多樣，針對黍稷抗旱、耐高溫及蒸騰速率低等優(yōu)良特性進行遺傳多樣性評價和遺傳背景分析，有助于對抗旱、保水等基因資源的挖掘和高效利用[9]，也有助于黍稷品種資源的鑒定、選育、改良。

利用分子標記開展作物遺傳多樣性分析是作物種質(zhì)資源遺傳背景研究的重要手段，微衛(wèi)星標記作為重要的遺傳標記之一[10]，可以有效鑒別基因型，目前被廣泛用于構建指紋圖譜[11]、評估作物遺傳多樣性[12]以及鑒定品種等方面[13-14]。隨著微衛(wèi)星標記迅速發(fā)展，利用其對黍稷遺傳背景研究已經(jīng)成為主流方式。HU等[15]最先利用種間SSR標記分析了我國糜子的遺傳差異特性。2010年，CHO等[16]首次構建了25個黍稷微衛(wèi)星標記，并針對50份供試材料分析黍稷資源遺傳多樣性與遺傳結構。石甜甜等[17]用144個SSR標記評估國內(nèi)外5個生態(tài)區(qū)黍稷材料的遺傳差異性，并對基礎數(shù)據(jù)做了綜合分析，發(fā)現(xiàn)北方春糜子區(qū)的遺傳多樣性更為豐富，為北方春糜子區(qū)黍稷材料的遺傳研究和遺傳育種指出了方向。HUNT等[18]利用16個微衛(wèi)星位點成功將歐亞大陸98個地方品種的遺傳多樣性進行分析，探討了黍稷在歐亞大陸范圍內(nèi)的系統(tǒng)地理結構。RAJPUT等[14]運用比較基因組學發(fā)展了來源于柳枝稷基因組的SSR標記，檢測并評估柳枝稷SSR標記在糜子中的應用。王瑞云等[19]利用85對引物對我國6個生態(tài)地區(qū)的98份黍稷材料展開研究，分析得到的遺傳主要參數(shù)，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.400 0~0.728 1，平均為0.472 3。連帥等[20]研究了5個生態(tài)地區(qū)的40份黍稷的遺傳多樣性，結果發(fā)現(xiàn)15個等位變異，平均多態(tài)性信息含量為0.48。董俊麗等[21]利用96份黍稷種質(zhì)資源對我國各地區(qū)的黍稷資源的遺傳差別進行了分析，同時也研究了我國黍稷與俄羅斯黍稷之間的遺傳差異，結果表明，俄羅斯的黍稷資源與我國的黍稷資源有較大的差別，我國和俄羅斯的黍稷種質(zhì)資源有很大的遺傳距離。LIU等[22]采用67對SSR引物對4個群組的黍稷栽培種和地方品種的遺傳多樣性進行評估并分析其主成分，共檢測到179個等位變異，共有67個標記，平均為2.672，有效等位基因數(shù)（Ne）平均為1.995，遺傳多樣性指數(shù)（I）平均為0.725。王璐琳等[23]開發(fā)了17個微衛(wèi)星標記，并分析了不同黍稷之間的遺傳差異，新標記使得黍稷分子標記更為豐富，方便了對黍稷的遺傳研究?？苁缇萚24]利用22對引物對國內(nèi)131份黍稷材料進行遺傳多樣性分析，共檢測出128個主要等位變異，平均每個位點為5.82，I平均為0.628 4，Ne平均為0.587 4，結果表明，不同生態(tài)區(qū)的黍稷資源遺傳差異較大，但不同生態(tài)區(qū)之間存在基因交流。盡管前人利用分子標記對黍稷遺傳多樣性進行了大量研究，但目前尚缺乏可進行準確可靠遺傳差異分析的分子標記，所以，構建大批微衛(wèi)星標記以促進黍稷的高效利用勢在必行[25]。而且我國黍稷資源眾多，各個地區(qū)遺傳差異性較大，遺傳背景復雜，而黍稷屬于小雜糧作物，對資源遺傳多樣性的研究也不夠。

本研究利用80對高基元SSR引物對48份北方春糜子區(qū)的黍稷材料進行PCR擴增檢測其多態(tài)性，以了解北方春糜子生態(tài)區(qū)的黍稷遺傳差異，旨在為進一步改良種質(zhì)資源和篩選優(yōu)質(zhì)基因提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為48份黍稷資源，來自中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所（具有統(tǒng)一編號），農(nóng)家種和育成品種（無統(tǒng)一編號）由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院糜子分子育種實驗室收集，分布于北方春糜子區(qū)的青海、甘肅、內(nèi)蒙古、山西等4個省份（表1）。

表1 48份黍稷資源概況Tab.1 Overview of 48 broomcorn millet resources

1.2 基因組DNA提取與DNA質(zhì)量檢測

選取試驗材料，剪取三葉期幼苗葉片，用保鮮袋封存放置在-80℃冰箱備用。利用改良的CTAB法[26]將葉片進行研磨后經(jīng)過離心管離心提取黍稷基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用NanodropND1000核酸濃度檢測儀檢測DNA的濃度。測定濃度后加入雙純水稀釋濃度調(diào)至30~80 ng/μL。

1.3 PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

PCR反應體系及擴增程序來源于陳小紅等[25]的方法，退火溫度根據(jù)不同Tm值設定，PCR產(chǎn)物于4℃保存，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將不同樣品PCR擴增出條帶以（0，1）進行記錄，構建數(shù)字指紋圖譜。用PowerMarker 3.25[27]分析多態(tài)性信息含量，用PopGen 1.32[28]對80對SSR引物擴增的產(chǎn)物進行多樣性分析，用MEGA 5.0[29]構建聚類圖，用Structure 2.2[30]分析群體遺傳結構，用NTSYSpc 2.11進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 基于特異性SSR標記的遺傳多樣性分析

用80對高基元SSR引物擴增48份黍稷材料，結果表明（表2），在48份材料中檢測到206個等位變異，共有80個標記，每個位點檢測到2~3個，平均為2.575個；其中，產(chǎn)生2個變異的位點有34個，產(chǎn)生3個變異的位點有46個。80個位點多樣性指數(shù)介 于0.665 5（RYW95）~1.078 6（RYW166），平均為0.860 8；有效等位基因數(shù)介于1.896 1（RYW95）~2.888 7（RYW166），平均為2.312 6。Nei's期望雜合度最大的是0.653 8，最小的是0.472 6，平均為0.559 3。80個位點PIC值介于0.185 0（RYW151）~0.706 2（RYW111），平均為0.453 6。

表2 80對引物測定的遺傳參數(shù)Tab.2 Genetic parameters measured by 80 pairs of primers

續(xù)表2 80對引物測定的遺傳參數(shù)Tab.2（Continued） Genetic parameters measured by 80 pairs of primers

2.2 不同來源黍稷資源群體間的遺傳變異分析

對北方春糜子區(qū)的4個省區(qū)黍稷資源的遺傳多樣性參數(shù)進行分析（表3），發(fā)現(xiàn)青海材料PIC值最高，山西的PIC值最低。甘肅與山西試材的遺傳距離（0.045 6）最大（表4），遺傳一致度（0.955 5）最低；內(nèi)蒙古與山西試材的遺傳距離（0.028 6）最小，遺傳一致度（0.973 6）最高。

表3 不同來源黍稷的遺傳多樣性分析Tab.3 Genetic diversity analysis of broomcorn millet from di fferent sources

表4 不同群體黍稷資源的遺傳距離與遺傳一致度Tab.4 Genetic distance and genetic consistency of different populations of broomcorn millet resources

2.3 不同地區(qū)黍稷的聚類分析

根據(jù)UPGMA聚類（圖1），將48份試材歸為3個群組，第Ⅰ群組含有5份試材，其中青海資源最多（4份），占80%。第Ⅱ群組有17份試材，主要包括山西資源（9份），占52.94%。第Ⅲ群組有26份試材，包含甘肅和內(nèi)蒙古的黍稷資源，甘肅黍稷資源（9份）占34.62%，內(nèi)蒙古黍稷資源（12份）占46.15%。從聚類分析可以看出，第Ⅰ類群有著少量的甘肅黍稷，第Ⅱ類群有著少量的內(nèi)蒙古黍稷和甘肅黍稷，第Ⅲ類群有著少量的山西黍稷，各群體之間存在著少量的交叉現(xiàn)象。

2.4 基于模型的黍稷資源群體結構分析

對黍稷試材的所有基因建庫，然后建立模型進行群體結構分析，發(fā)現(xiàn)48份黍稷試材的等位變異頻率特征數(shù)Delta K在K=4處峰值明顯（圖2）。

利用Structure將黍稷試材劃分為4個群組（表5、圖3）。其中，紅色類群9份，包括青海5份、甘肅2份、內(nèi)蒙古1份、山西1份；綠色類群14份，包括青海3份、甘肅3份、內(nèi)蒙古6份、山西2份；藍色類群12份，包括青海2份、甘肅6份、內(nèi)蒙古2份、山西2份；黃色類群13份，包括青海3份、內(nèi)蒙古5份、山西5份。

表5 遺傳結構圖中各類群的統(tǒng)計Tab.5 Statistics of groups in structure graph 份

對K=4遺傳結構（圖3）和每個類群的遺傳多樣性參數(shù)進行分析評估（表6）。從PIC值來看，紅色類群（0.467 9）＞藍色類群（0.397 6）＞綠色類群（0.382 7）＞黃色類群（0.377 9）；根據(jù)多樣性指數(shù)比較可以得到，紅色類群（0.848 0）＞藍色類群（0.845 9）＞綠色類群（0.836 9）＞黃色類群（0.805 3）；紅色類群的參數(shù)均最高；黃色類群的參數(shù)均最低。綜合來看，4個類群的遺傳多樣性豐富度的大小為紅色類群＞藍色類群＞綠色類群＞黃色類群。

表6 遺傳結構圖中各分類群的多樣性統(tǒng)計Tab.6 Diversity statistics of groups in structure graph

2.5 不同地區(qū)黍稷的主成分分析

從圖4可以看出，前3個主要組件PC1（Dim-1）、PC2（Dim-2）、PC3（Dim-3）分別解釋總方差的14.80%、5.04%、4.31%，這些主要組件累積解釋了24.15%的遺傳變異。PC將北方春糜子區(qū)的所有黍稷試材劃分為了4個類群，第1類群共13份，全部來自青海；第2類群共10份，全部來自甘肅；第3類群共17份，其中包括內(nèi)蒙古的全部試材，1份甘肅試材和2份山西試材；第4類群共8份，全部來自山西，這與聚類分析結果基本一致。

3 結論與討論

劉笑瑜等[31]通過6對黍稷特異性SSR對40份黍稷種質(zhì)資源進行研究，共檢測出20個等位基因變異，平均多樣性指數(shù)為0.54，PIC平均值為0.34。連帥等[32]從162對SSR引物中篩選出了63對具有多態(tài)性的引物，利用這些多態(tài)性引物檢測出161種等位變異，平均多樣性指數(shù)為0.627 5，PIC平均值為0.485 5。王瑞云等[33]用85對高基元SSR擴增96份國內(nèi)黍稷資源，共檢測出232個等位變異位點，平均多樣性指數(shù)為0.770 8，PIC平均值為0.472 3。本試驗用80對SSR引物檢測分析后得到206個等位變異位點，平均為2.575個；多樣性指數(shù)為0.665 5~1.078 6，平均為0.860 8，PIC平均值為0.453 6。本研究的PIC值比劉笑瑜等[31]的PIC值高，可能是由于本次試驗材料比較單一。但本研究發(fā)現(xiàn)，RYW111的各遺傳參數(shù)都比較高，尤其是PIC值，說明RYW111有很好的遺傳變異潛力。本研究與連帥等[32]相比較平均PIC值較低，主要是由于本試驗材料選自一個生態(tài)區(qū)，而連帥等[32]選取的國內(nèi)外黍稷資源來自不同生態(tài)區(qū)，遺傳差異較大，遺傳背景較為豐富。本研究與王瑞云等[33]相比平均PIC值較低，主要是由于王瑞云等[33]試材地理來源差異顯著。

王瑞云等[34]根據(jù)遺傳距離，用15個標記將132份黍稷材料進行UPGMA聚類，共分為4個群組，包括群組Ⅰ（北方春糜子區(qū)）、群組Ⅱ（黃土高原春、東北春糜子區(qū)、夏糜子區(qū)、北方夏糜子區(qū)和北方春糜子區(qū)）、群組Ⅲ（黃土高原春、夏糜子區(qū)）、群組Ⅳ（黃土高原春、北方春糜子區(qū)、夏糜子區(qū)、東北春糜子區(qū)）。連帥等[32]將192個材料劃分為10個參試群體，采用UPGMA法繪制了樹狀聚類圖，發(fā)現(xiàn)其遺傳距離頻率在0.06~0.37，頻率為0.09時將所有參驗材料分為三大群組，發(fā)現(xiàn)地理位置差異對聚類分析有一定影響。本研究則利用UPGMA將北方春糜子區(qū)的48份試材劃分為3個主要類群，發(fā)現(xiàn)以UPGMA為依據(jù)劃分的第3類群包括來自甘肅、內(nèi)蒙古、青海、山西的材料，而來自青海的材料在3個類群中都有分布?；赟tructure的聚類結果表明，第1類群、第2類群、第3類群都包括甘肅、內(nèi)蒙古、青海、山西的材料，第4類群包括青海、內(nèi)蒙古、山西的材料，4個類群中都有青海、內(nèi)蒙古、山西的材料。一般來說，北方春糜子區(qū)的每個省份都有相對清晰的群體結構，與其地理起源基本一致，與BONMAN等[35]、王舒婷等[36]關于大宗作物和山西黍稷的研究結果一致。結果表明，從類群Ⅰ到類群Ⅲ的遺傳參數(shù)有著明顯的差異，還可以清楚地看出各選材的親緣關系，但群體之間有少數(shù)交叉現(xiàn)象，與王瑞云等[34]具有類似的結果，材料地理來源對聚類有一定的影響。HUNT等[18]用16個微衛(wèi)星位點對98份黍稷地方品種進行遺傳結構的分析，聚類分析發(fā)現(xiàn)，每個集群都顯示出明確的地理相關。本研究用Structure 2.2對結果進行聚類分析，在K=2時，將材料劃分為2個類群，K=4時，劃分4個類群。其結果也表明，遺傳距離聚類與地理來源有關。

本試驗的48份資源可以劃分為4個類群，群組劃分的結果與試材來源省份密切相關。紅色類群收集的青海黍稷更多，多樣性指數(shù)和PIC值更高，而黃色類群收集的山西黍稷資源更多，多樣性指數(shù)和PIC值較低，這表明青海與山西間遺傳結構有很大差異?？傮w而言，紅色類群的遺傳多樣性參數(shù)為最高；黃色類群的遺傳多樣性參數(shù)都為最低。結果表明，青海材料的遺傳多樣性較豐富，而山西材料的遺傳多樣性較低一些。

本研究結果表明，80對高基元SSR引物可檢測北方春糜子區(qū)48個黍稷材料的多態(tài)性；青海省黍稷種質(zhì)資源的遺傳多樣性參數(shù)最為豐富，遺傳背景更為復雜；遺傳聚類群與參試材料地理來源基本一致。