常 麗，劉 偉，李曉梅，3，譚 敏，3，劉政海，3，楊镕兆，3，楊兆亮，3，紀(jì) 薇，董志剛，3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 果樹研究所，山西 太原 030031；3.山西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，山西 太原 030031）

為適應(yīng)生態(tài)環(huán)境，植物在生命活動(dòng)中產(chǎn)生了一系列次生代謝物，其不僅參與植物的生長發(fā)育，且在生命活動(dòng)的許多方面都起到了重要作用，可以幫助提高植物自身抗性，更好地抵御外界不良環(huán)境的侵害[1-2]。另外，由于特定的生物活性和較高的藥用價(jià)值，植物次生代謝物當(dāng)前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品以及農(nóng)藥等工業(yè)領(lǐng)域[3]。

黃酮醇是植物苯丙烷代謝途徑中產(chǎn)生的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃酮醇合酶（FLS）等關(guān)鍵酶在其生物合成積累中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。有研究顯示，MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控黃酮醇生物合成是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，即其可以單獨(dú)或與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體從而調(diào)節(jié)CHS、CHI、FLS等關(guān)鍵酶基因表達(dá)[5]。AtMYB111主要在擬南芥子葉中表達(dá)，可以激活黃酮醇生物合成過程中關(guān)鍵基因（CHS、F3H、FLS等）的表達(dá)，促進(jìn)黃酮醇的生物合成[6]。BLANCO等[7]通過凝膠遷移和轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，仙人掌中CcMYB12可與編碼黃酮生物合成酶基因的啟動(dòng)子元件結(jié)合，通過激活黃酮醇生物合成基因，參與調(diào)控黃酮醇的生物合成。CAO等[8]對(duì)桃果實(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量發(fā)現(xiàn)，PpMYB15和PpMYBF1的轉(zhuǎn)錄水平與黃酮含量及黃酮合成酶的表達(dá)密切相關(guān)；雙重?zé)晒馑孛阜治霰砻?，PpMYB15和PpMYBF1可反式激活類黃酮生物合成基因的啟動(dòng)子PpCHS1、PpCHI1、PpF3H、PpFLS1，調(diào)控黃酮醇生物合成及植物組織呈色。WANG等[9]通過蘋果愈傷組織中的過表達(dá)和擬南芥中的異位表達(dá)確定，MdMYB22可通過直接與黃酮醇合酶啟動(dòng)子結(jié)合來激活黃酮醇途徑。在甜橙[10]、梨[11]、苦蕎[12]等物種中也進(jìn)行了相關(guān)研究，因其獨(dú)特的生理特性和優(yōu)良的生物學(xué)功能，黃酮醇已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[13]。

葡萄（Vitis vinifera）是公認(rèn)的最古老的水果之一，其栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列，在我國栽培廣泛，是重要的經(jīng)濟(jì)作物[14]。葡萄果實(shí)中的次生代謝物黃酮醇的含量不僅是影響其品質(zhì)形成的主要因素，同時(shí)對(duì)葡萄果實(shí)中的營養(yǎng)成分構(gòu)成也起著重要作用[15]。黃酮醇在葡萄果實(shí)中的積累以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式進(jìn)行[16]，其可以調(diào)控果皮色澤及營養(yǎng)物質(zhì)積累[17]。近年來，因MYBF基因與黃酮醇代謝相關(guān)而被重視，于2009年首次報(bào)道了葡萄中的2個(gè)MYBF序列[18]。瞬時(shí)報(bào)告基因分析表明，VvMYBF1是黃酮醇合酶1的特異性激活子，進(jìn)一步證實(shí)了VvMYBF1作為黃酮醇合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能。VvMYBF 2不同于Vv MYBF 1，它不存在黃酮醇調(diào)節(jié)因子特異性SG7基序。

鑒于VvMYBF2的特殊性以及黃酮醇對(duì)葡萄果實(shí)和葡萄酒風(fēng)味和營養(yǎng)上的重要貢獻(xiàn)，本研究通過對(duì)釀酒葡萄VvMYBF 2基因序列分析和表達(dá)模式分析，初步探究葡萄中VvMYBF2的表達(dá)模式及功能，以期為提高葡萄中黃酮醇含量、改善葡萄營養(yǎng)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料均來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所。所選試材為品麗珠、赤霞珠和霞多麗3個(gè)釀酒葡萄品種，采集葡萄樣品包括莖（嫩莖）、葉（嫩葉）、芽（冬芽）、花（95%開放），以及成熟期的果皮與果肉。樣品經(jīng)液氮速凍處理后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因序列分析 從NCBI獲取基因序列（登錄號(hào)XP_002271862.1），利用Ex PASy軟件對(duì)葡萄VvMYBF基因進(jìn)行蛋白特性分析；通過在線分析工具Protscale對(duì)蛋白親疏水性進(jìn)行進(jìn)一步分析；利用在線工具TMHMM進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；應(yīng)用SignaIP進(jìn)行信號(hào)肽分析；用在線軟件NetPhos 2.0 Serve預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)[19]；利用TBtools和MEME在線軟件分析基因結(jié)構(gòu)和保守基序；利用54個(gè)不同葡萄組織（GSE36128）[20]中VvMYBF2基因的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄物表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建表達(dá)熱圖，以了解該基因的組織特異表達(dá)情況。

1.2.2 RNA的提取及cDNA合成 利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）進(jìn)行所有葡萄樣品的RNA提取。使用Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)提取的RNA的濃度及純度。利用Go Script?Reverse Transcription System（A5000）試劑盒進(jìn)行cDNA第1條鏈的合成。

1.2.3VvMYBF2基因的表達(dá)特性分析 根據(jù)VvMYBF2的ORF序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物qF和q R（表1）。以品麗珠、赤霞珠和霞多麗的第1鏈cDNA為模板，采用q RT-PCR分析VvMYBF2的表達(dá)模式。反應(yīng)體系為：c DNA模板2μL、上下游引物各0.5μL、qPCR mix 10μL、ddH2O 7μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)。

表1 VvMYBF2熒光定量所用引物序列Tab.1 Primer sequences used for VvMYBF2 fluorescence quantification

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

黃酮醇及其他酚類物質(zhì)含量測(cè)定均采用分光光度計(jì)法，總酚和單寧含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定[21]，原花色素含量采用正丁醇-鹽酸比色法測(cè)定[22]，總類黃酮含量通過氯化鋁比色法測(cè)定[21]，參考WATERHOUSE等[23]的方法測(cè)定黃烷醇含量，黃酮醇測(cè)定參照文獻(xiàn)[24-25]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvMYBF2的生物信息學(xué)分析

由表2可知，葡萄VvMYBF2基因編碼383個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為42.52 ku，為不穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。進(jìn)一步分析可知（圖1），親水氨基酸（負(fù)值）稍多于疏水的（正值），該蛋白表現(xiàn)為親水性；無跨膜結(jié)構(gòu)域，且無信號(hào)肽存在；此外，磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)共有29個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，絲氨酸可能的磷酸化位點(diǎn)最多，為20個(gè)，蘇氨酸和酪氨酸可能的磷酸化位點(diǎn)分別為8、1個(gè)。

由圖2可知，Vv MYBF2在染色體上的區(qū)域略小于VvMYBF1，二者都含有3個(gè)外顯子，但分布存在差異，VvMYBF1的第1號(hào)和第2號(hào)外顯子間隔區(qū)域較長，第2號(hào)和第3號(hào)外顯子間隔區(qū)域較短；而VvMYBF2與其相反，第1號(hào)和第2號(hào)外顯子間隔區(qū)域較短，第2號(hào)和第3號(hào)外顯子間隔區(qū)域較長。二者均含有10個(gè)Motif，其中Motif1、Motif2、Motif3在序列上的分布一致，其余Motif分布存在差異。

表2 Vv MYBF2蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)Tab.2 Basic physicochemical properties of VvMYBF2 proteins

為了解VvMYBF2基因在葡萄發(fā)育過程中的作用，分析其在葡萄54個(gè)不同組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖3所示。圖3中從左往右依次是芽—萌芽、花—開花（50%）、外果皮—收獲后枯萎Ⅰ（第1個(gè)月）、芽—芽裂、果皮—坐果后、莖—綠色莖、葉—衰老葉、果皮—成熟、卷須—成熟須（坐果）、果皮—中熟、芽—綠尖、果皮—收獲后枯萎Ⅰ（第1個(gè)月）、果肉—坐果后、果肉—轉(zhuǎn)色期、果肉—中熟、花序—幼花序、葉軸—坐果期、葉軸—轉(zhuǎn)色期、葉軸—坐果后、葉軸—成熟、雄蕊、葉軸—中熟、葉—幼葉、果肉—成熟、果皮—收獲后枯萎Ⅱ（第1個(gè)月）、種子—坐果、幼苗、果肉-收獲后枯萎Ⅰ（第1個(gè)月）、果皮—轉(zhuǎn)色期、芽—冬芽、外果皮—坐果后、50%以上開花的花粉、外果皮—成熟、芽—潛芽、葉—成熟葉、果肉—收獲后枯萎Ⅲ（第3個(gè)月）、果皮—收獲后枯萎Ⅲ（第3個(gè)月）、花序—發(fā)育良好的花序、花—開始開花（10%）、莖—木質(zhì)莖、卷須—發(fā)育良好的卷須（12片葉）、外果皮-收獲后枯萎Ⅱ（第2個(gè)月）、外果皮—中熟、卷須—幼卷須（7片葉）、花瓣、種子—中熟、果肉—收獲后枯萎Ⅱ（第2個(gè)月）、種子—轉(zhuǎn)色期、果皮—坐果期、心皮、根、外果皮—收獲后枯萎Ⅲ（第3個(gè)月）、種子—坐果后、外果皮—轉(zhuǎn)色期。圖3結(jié)果顯示，該基因在不同組織中的表達(dá)存在較大差異，其在果皮、芽、葉以及卷須中表達(dá)量相對(duì)較高，或許是參與了這些組織部位的形成發(fā)育，具體功能還需進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)研究來驗(yàn)證。

2.2 VvMYBF2基因的表達(dá)分析

葡萄組織中VvMYBF2的表達(dá)量如圖4所示。

由圖4可知，VvMYBF2基因在葡萄果皮的表達(dá)量最高，尤以霞多麗果皮中表達(dá)量最高，分別為赤霞珠、品麗珠表達(dá)量的6.9、15.7倍；果肉中霞多麗和品麗珠基因表達(dá)量顯著高于赤霞珠（P<0.05）；葉片中則相反，赤霞珠基因表達(dá)量顯著高于霞多麗和品麗珠（P<0.05）；其他組織中VvMYBF2基因表達(dá)量均以霞多麗顯著高于赤霞珠和品麗珠（P<0.05）。

2.3 葡萄果實(shí)中次生代謝物含量分析

不同品種葡萄果實(shí)中的次生代謝物含量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如圖5所示，果皮中次生代謝物含量遠(yuǎn)高于果肉；果皮中次生代謝物黃烷醇含量相對(duì)較高，原花色素含量較低，各次生代謝物含量大小在品種間均表現(xiàn)為赤霞珠＞品麗珠＞霞多麗，且差異顯著（P<0.05）；果肉中總酚含量較高，原花色素和黃酮醇含量極低，不同品種果肉中單寧和黃烷醇含量差異不顯著，總酚、原花色素、總類黃酮和黃酮醇含量均以赤霞珠最高，其中總類黃酮和黃酮醇含量差異顯著（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

結(jié)構(gòu)與功能之間有著密不可分的聯(lián)系，結(jié)構(gòu)決定生物學(xué)功能，結(jié)構(gòu)相似其功能相似。本研究中，VvMYBF2基因編碼了383個(gè)氨基酸，與甜橙[15]、苦蕎[17]、甜蕎[26]等多個(gè)物種中存在差異，可能是在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了丟失或增長。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，VvMYBF2與已報(bào)道的VvMYBF1的外顯子數(shù)量（3個(gè)）和Motif類型、數(shù)量（10個(gè)）相同，差別在于編碼氨基酸數(shù)、外顯子結(jié)構(gòu)、Motif順序；進(jìn)一步組織表達(dá)特異性分析顯示，VvMYBF2在果皮、果肉中表達(dá)量相對(duì)較高，與已知的VvMYBF1在漿果發(fā)育早期的芽和花中高表達(dá)、開花后表達(dá)減少有所不同，可能是由于結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)上的差異導(dǎo)致了其在表達(dá)上存在組織差異。

張娟等[27]測(cè)定了果實(shí)不同部位的酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)果皮中酚類物質(zhì)含量顯著高于果肉中，BAYDAR[24]等測(cè)定了果實(shí)中的黃酮醇含量，發(fā)現(xiàn)黃酮醇主要存在于葡萄果皮中，這些均與本試驗(yàn)結(jié)果一致，即這些次生代謝物主要存在于葡萄果皮中。本研究發(fā)現(xiàn)，不同葡萄果實(shí)中原花色素與黃酮醇變化趨勢(shì)一致，且紅色品種中兩種物質(zhì)含量顯著高于白色品種，推測(cè)是紅色品種中生成的二氫黃酮醇更多，因此相對(duì)合成了較多的黃酮醇與原花色素。

定量試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，VvMYBF2在紅、白葡萄品種黃酮醇的合成中均有一定貢獻(xiàn)，紅色品種中VvMYBF2的表達(dá)量與其黃酮醇含量成正比，而白色品種霞多麗中VvMYBF2表達(dá)量最高但其黃酮醇含量卻最低，或許由于該基因在不同品種中的表達(dá)存在差異，黃酮醇合成受多個(gè)基因調(diào)控；也可能是由于其他調(diào)控因子導(dǎo)致其黃酮醇含量的降低，總之對(duì)于紅、白葡萄品種中的差異表達(dá)仍需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。CZEMMEL等[18]以西拉為試驗(yàn)材料，探究了果實(shí)發(fā)育過程中VvMYBF1與黃酮醇含量關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該基因可促進(jìn)轉(zhuǎn)色前果實(shí)中黃酮醇含量的增加，進(jìn)入成熟期后，該基因的表達(dá)量降低。本試驗(yàn)進(jìn)行了不同品種成熟期VvMYBF2與黃酮醇含量分析，發(fā)現(xiàn)在品麗珠和赤霞珠中，該基因表達(dá)量與黃酮醇含量成正比，即該基因促進(jìn)成熟期果實(shí)中黃酮醇的合成，或許VvMYBF1主要在發(fā)育早期促進(jìn)黃酮醇的積累，而VvMYBF2主要在葡萄成熟期發(fā)揮作用，以提高果皮中黃酮醇含量，這還需要進(jìn)一步開展果實(shí)發(fā)育動(dòng)態(tài)研究來驗(yàn)證。另外，在品麗珠和赤霞珠中，注意到黃酮醇以外的次生代謝物含量與VvMYBF2基因的表達(dá)量一致，赤霞珠中VvMYBF2基因表達(dá)量高于品麗珠，其果實(shí)次生代謝物含量也高于品麗珠，推測(cè)該基因或許也參與其他次生代謝物的調(diào)控。

綜上可知，VvMYBF2和VvMYBF1基因結(jié)構(gòu)相似，但編碼氨基酸數(shù)、外顯子結(jié)構(gòu)、Motif順序等方面存在差異，導(dǎo)致二者在調(diào)控黃酮醇合成的時(shí)期及組織部位上的差異；紅色品種赤霞珠和白色品種霞多麗果皮中VvMYBF2的表達(dá)量與黃酮醇等次生代謝物含量呈負(fù)相關(guān)，紅色品種品麗珠和赤霞珠果皮中VvMYBF2的表達(dá)量與黃酮醇等次生代謝物含量呈正相關(guān)，說明VvMYBF2可以調(diào)控黃酮醇等次生代謝物的合成，在葡萄果皮著色上具有重要作用。