常 麗，劉 偉，李曉梅，3，譚 敏，3，劉政海，3，楊镕兆，3，楊兆亮，3，紀 薇，董志剛，3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 果樹研究所，山西 太原 030031；3.山西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，山西 太原 030031）

為適應生態(tài)環(huán)境，植物在生命活動中產(chǎn)生了一系列次生代謝物，其不僅參與植物的生長發(fā)育，且在生命活動的許多方面都起到了重要作用，可以幫助提高植物自身抗性，更好地抵御外界不良環(huán)境的侵害[1-2]。另外，由于特定的生物活性和較高的藥用價值，植物次生代謝物當前被廣泛應用于醫(yī)藥、化工、食品以及農(nóng)藥等工業(yè)領域[3]。

黃酮醇是植物苯丙烷代謝途徑中產(chǎn)生的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構酶（CHI）、黃酮醇合酶（FLS）等關鍵酶在其生物合成積累中發(fā)揮關鍵作用[4]。有研究顯示，MYB轉錄因子調(diào)控黃酮醇生物合成是在轉錄水平上進行的，即其可以單獨或與其他轉錄因子形成復合體從而調(diào)節(jié)CHS、CHI、FLS等關鍵酶基因表達[5]。AtMYB111主要在擬南芥子葉中表達，可以激活黃酮醇生物合成過程中關鍵基因（CHS、F3H、FLS等）的表達，促進黃酮醇的生物合成[6]。BLANCO等[7]通過凝膠遷移和轉基因研究發(fā)現(xiàn)，仙人掌中CcMYB12可與編碼黃酮生物合成酶基因的啟動子元件結合，通過激活黃酮醇生物合成基因，參與調(diào)控黃酮醇的生物合成。CAO等[8]對桃果實進行實時熒光定量發(fā)現(xiàn)，PpMYB15和PpMYBF1的轉錄水平與黃酮含量及黃酮合成酶的表達密切相關；雙重熒光素酶分析表明，PpMYB15和PpMYBF1可反式激活類黃酮生物合成基因的啟動子PpCHS1、PpCHI1、PpF3H、PpFLS1，調(diào)控黃酮醇生物合成及植物組織呈色。WANG等[9]通過蘋果愈傷組織中的過表達和擬南芥中的異位表達確定，MdMYB22可通過直接與黃酮醇合酶啟動子結合來激活黃酮醇途徑。在甜橙[10]、梨[11]、苦蕎[12]等物種中也進行了相關研究，因其獨特的生理特性和優(yōu)良的生物學功能，黃酮醇已成為當前的研究熱點之一[13]。

葡萄（Vitis vinifera）是公認的最古老的水果之一，其栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列，在我國栽培廣泛，是重要的經(jīng)濟作物[14]。葡萄果實中的次生代謝物黃酮醇的含量不僅是影響其品質形成的主要因素，同時對葡萄果實中的營養(yǎng)成分構成也起著重要作用[15]。黃酮醇在葡萄果實中的積累以游離態(tài)和結合態(tài)2種形式進行[16]，其可以調(diào)控果皮色澤及營養(yǎng)物質積累[17]。近年來，因MYBF基因與黃酮醇代謝相關而被重視，于2009年首次報道了葡萄中的2個MYBF序列[18]。瞬時報告基因分析表明，VvMYBF1是黃酮醇合酶1的特異性激活子，進一步證實了VvMYBF1作為黃酮醇合成的轉錄調(diào)控因子的功能。VvMYBF 2不同于Vv MYBF 1，它不存在黃酮醇調(diào)節(jié)因子特異性SG7基序。

鑒于VvMYBF2的特殊性以及黃酮醇對葡萄果實和葡萄酒風味和營養(yǎng)上的重要貢獻，本研究通過對釀酒葡萄VvMYBF 2基因序列分析和表達模式分析，初步探究葡萄中VvMYBF2的表達模式及功能，以期為提高葡萄中黃酮醇含量、改善葡萄營養(yǎng)品質奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料均來自山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所。所選試材為品麗珠、赤霞珠和霞多麗3個釀酒葡萄品種，采集葡萄樣品包括莖（嫩莖）、葉（嫩葉）、芽（冬芽）、花（95%開放），以及成熟期的果皮與果肉。樣品經(jīng)液氮速凍處理后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因序列分析 從NCBI獲取基因序列（登錄號XP_002271862.1），利用Ex PASy軟件對葡萄VvMYBF基因進行蛋白特性分析；通過在線分析工具Protscale對蛋白親疏水性進行進一步分析；利用在線工具TMHMM進行跨膜結構域分析；應用SignaIP進行信號肽分析；用在線軟件NetPhos 2.0 Serve預測磷酸化位點[19]；利用TBtools和MEME在線軟件分析基因結構和保守基序；利用54個不同葡萄組織（GSE36128）[20]中VvMYBF2基因的標準化轉錄物表達數(shù)據(jù)構建表達熱圖，以了解該基因的組織特異表達情況。

1.2.2 RNA的提取及cDNA合成 利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）進行所有葡萄樣品的RNA提取。使用Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀檢測提取的RNA的濃度及純度。利用Go Script?Reverse Transcription System（A5000）試劑盒進行cDNA第1條鏈的合成。

1.2.3VvMYBF2基因的表達特性分析 根據(jù)VvMYBF2的ORF序列設計實時熒光定量PCR引物qF和q R（表1）。以品麗珠、赤霞珠和霞多麗的第1鏈cDNA為模板，采用q RT-PCR分析VvMYBF2的表達模式。反應體系為：c DNA模板2μL、上下游引物各0.5μL、qPCR mix 10μL、ddH2O 7μL。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，45個循環(huán)。

表1 VvMYBF2熒光定量所用引物序列Tab.1 Primer sequences used for VvMYBF2 fluorescence quantification

1.3 測定項目及方法

黃酮醇及其他酚類物質含量測定均采用分光光度計法，總酚和單寧含量測定采用Folin-Ciocalteu法測定[21]，原花色素含量采用正丁醇-鹽酸比色法測定[22]，總類黃酮含量通過氯化鋁比色法測定[21]，參考WATERHOUSE等[23]的方法測定黃烷醇含量，黃酮醇測定參照文獻[24-25]方法進行。

2 結果與分析

2.1 VvMYBF2的生物信息學分析

由表2可知，葡萄VvMYBF2基因編碼383個氨基酸，分子質量為42.52 ku，為不穩(wěn)定的酸性蛋白質。進一步分析可知（圖1），親水氨基酸（負值）稍多于疏水的（正值），該蛋白表現(xiàn)為親水性；無跨膜結構域，且無信號肽存在；此外，磷酸化位點預測分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質共有29個磷酸化位點，其中，絲氨酸可能的磷酸化位點最多，為20個，蘇氨酸和酪氨酸可能的磷酸化位點分別為8、1個。

由圖2可知，Vv MYBF2在染色體上的區(qū)域略小于VvMYBF1，二者都含有3個外顯子，但分布存在差異，VvMYBF1的第1號和第2號外顯子間隔區(qū)域較長，第2號和第3號外顯子間隔區(qū)域較短；而VvMYBF2與其相反，第1號和第2號外顯子間隔區(qū)域較短，第2號和第3號外顯子間隔區(qū)域較長。二者均含有10個Motif，其中Motif1、Motif2、Motif3在序列上的分布一致，其余Motif分布存在差異。

表2 Vv MYBF2蛋白質基本理化性質Tab.2 Basic physicochemical properties of VvMYBF2 proteins

為了解VvMYBF2基因在葡萄發(fā)育過程中的作用，分析其在葡萄54個不同組織中的轉錄組數(shù)據(jù)，結果如圖3所示。圖3中從左往右依次是芽—萌芽、花—開花（50%）、外果皮—收獲后枯萎Ⅰ（第1個月）、芽—芽裂、果皮—坐果后、莖—綠色莖、葉—衰老葉、果皮—成熟、卷須—成熟須（坐果）、果皮—中熟、芽—綠尖、果皮—收獲后枯萎Ⅰ（第1個月）、果肉—坐果后、果肉—轉色期、果肉—中熟、花序—幼花序、葉軸—坐果期、葉軸—轉色期、葉軸—坐果后、葉軸—成熟、雄蕊、葉軸—中熟、葉—幼葉、果肉—成熟、果皮—收獲后枯萎Ⅱ（第1個月）、種子—坐果、幼苗、果肉-收獲后枯萎Ⅰ（第1個月）、果皮—轉色期、芽—冬芽、外果皮—坐果后、50%以上開花的花粉、外果皮—成熟、芽—潛芽、葉—成熟葉、果肉—收獲后枯萎Ⅲ（第3個月）、果皮—收獲后枯萎Ⅲ（第3個月）、花序—發(fā)育良好的花序、花—開始開花（10%）、莖—木質莖、卷須—發(fā)育良好的卷須（12片葉）、外果皮-收獲后枯萎Ⅱ（第2個月）、外果皮—中熟、卷須—幼卷須（7片葉）、花瓣、種子—中熟、果肉—收獲后枯萎Ⅱ（第2個月）、種子—轉色期、果皮—坐果期、心皮、根、外果皮—收獲后枯萎Ⅲ（第3個月）、種子—坐果后、外果皮—轉色期。圖3結果顯示，該基因在不同組織中的表達存在較大差異，其在果皮、芽、葉以及卷須中表達量相對較高，或許是參與了這些組織部位的形成發(fā)育，具體功能還需進行進一步的試驗研究來驗證。

2.2 VvMYBF2基因的表達分析

葡萄組織中VvMYBF2的表達量如圖4所示。

由圖4可知，VvMYBF2基因在葡萄果皮的表達量最高，尤以霞多麗果皮中表達量最高，分別為赤霞珠、品麗珠表達量的6.9、15.7倍；果肉中霞多麗和品麗珠基因表達量顯著高于赤霞珠（P<0.05）；葉片中則相反，赤霞珠基因表達量顯著高于霞多麗和品麗珠（P<0.05）；其他組織中VvMYBF2基因表達量均以霞多麗顯著高于赤霞珠和品麗珠（P<0.05）。

2.3 葡萄果實中次生代謝物含量分析

不同品種葡萄果實中的次生代謝物含量統(tǒng)計學分析如圖5所示，果皮中次生代謝物含量遠高于果肉；果皮中次生代謝物黃烷醇含量相對較高，原花色素含量較低，各次生代謝物含量大小在品種間均表現(xiàn)為赤霞珠＞品麗珠＞霞多麗，且差異顯著（P<0.05）；果肉中總酚含量較高，原花色素和黃酮醇含量極低，不同品種果肉中單寧和黃烷醇含量差異不顯著，總酚、原花色素、總類黃酮和黃酮醇含量均以赤霞珠最高，其中總類黃酮和黃酮醇含量差異顯著（P<0.05）。

3 結論與討論

結構與功能之間有著密不可分的聯(lián)系，結構決定生物學功能，結構相似其功能相似。本研究中，VvMYBF2基因編碼了383個氨基酸，與甜橙[15]、苦蕎[17]、甜蕎[26]等多個物種中存在差異，可能是在進化過程中出現(xiàn)了丟失或增長。結構分析發(fā)現(xiàn)，VvMYBF2與已報道的VvMYBF1的外顯子數(shù)量（3個）和Motif類型、數(shù)量（10個）相同，差別在于編碼氨基酸數(shù)、外顯子結構、Motif順序；進一步組織表達特異性分析顯示，VvMYBF2在果皮、果肉中表達量相對較高，與已知的VvMYBF1在漿果發(fā)育早期的芽和花中高表達、開花后表達減少有所不同，可能是由于結構細節(jié)上的差異導致了其在表達上存在組織差異。

張娟等[27]測定了果實不同部位的酚類物質，發(fā)現(xiàn)果皮中酚類物質含量顯著高于果肉中，BAYDAR[24]等測定了果實中的黃酮醇含量，發(fā)現(xiàn)黃酮醇主要存在于葡萄果皮中，這些均與本試驗結果一致，即這些次生代謝物主要存在于葡萄果皮中。本研究發(fā)現(xiàn)，不同葡萄果實中原花色素與黃酮醇變化趨勢一致，且紅色品種中兩種物質含量顯著高于白色品種，推測是紅色品種中生成的二氫黃酮醇更多，因此相對合成了較多的黃酮醇與原花色素。

定量試驗數(shù)據(jù)表明，VvMYBF2在紅、白葡萄品種黃酮醇的合成中均有一定貢獻，紅色品種中VvMYBF2的表達量與其黃酮醇含量成正比，而白色品種霞多麗中VvMYBF2表達量最高但其黃酮醇含量卻最低，或許由于該基因在不同品種中的表達存在差異，黃酮醇合成受多個基因調(diào)控；也可能是由于其他調(diào)控因子導致其黃酮醇含量的降低，總之對于紅、白葡萄品種中的差異表達仍需進一步試驗探究。CZEMMEL等[18]以西拉為試驗材料，探究了果實發(fā)育過程中VvMYBF1與黃酮醇含量關系，發(fā)現(xiàn)該基因可促進轉色前果實中黃酮醇含量的增加，進入成熟期后，該基因的表達量降低。本試驗進行了不同品種成熟期VvMYBF2與黃酮醇含量分析，發(fā)現(xiàn)在品麗珠和赤霞珠中，該基因表達量與黃酮醇含量成正比，即該基因促進成熟期果實中黃酮醇的合成，或許VvMYBF1主要在發(fā)育早期促進黃酮醇的積累，而VvMYBF2主要在葡萄成熟期發(fā)揮作用，以提高果皮中黃酮醇含量，這還需要進一步開展果實發(fā)育動態(tài)研究來驗證。另外，在品麗珠和赤霞珠中，注意到黃酮醇以外的次生代謝物含量與VvMYBF2基因的表達量一致，赤霞珠中VvMYBF2基因表達量高于品麗珠，其果實次生代謝物含量也高于品麗珠，推測該基因或許也參與其他次生代謝物的調(diào)控。

綜上可知，VvMYBF2和VvMYBF1基因結構相似，但編碼氨基酸數(shù)、外顯子結構、Motif順序等方面存在差異，導致二者在調(diào)控黃酮醇合成的時期及組織部位上的差異；紅色品種赤霞珠和白色品種霞多麗果皮中VvMYBF2的表達量與黃酮醇等次生代謝物含量呈負相關，紅色品種品麗珠和赤霞珠果皮中VvMYBF2的表達量與黃酮醇等次生代謝物含量呈正相關，說明VvMYBF2可以調(diào)控黃酮醇等次生代謝物的合成，在葡萄果皮著色上具有重要作用。