劉亭亭， 李文紅， 汪漢成， 蔡劉體， 張長青， 穆 青

(1.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 湖北 荊州 434025； 2.貴州省植物保護(hù)研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴州 貴陽 550081； 4.貴州省煙草公司 黔西南州公司， 貴州 興義 562400)

0 引言

【研究意義】煙草是我國主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國云南、貴州、四川、湖南、湖北等省均有種植[1]，集約化育苗是我國煙草的主要育苗方式，以漂浮育苗和托盤育苗為主[2]。在環(huán)境條件適宜時，基質(zhì)土壤中的病原菌侵染煙苗導(dǎo)致發(fā)病，煙苗罹病后其煙苗各部位微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性改變，因此，了解煙苗患感病前后微生物群落的變化情況，對煙草苗期病害的防控具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在育苗期我國大部分煙草種植區(qū)長期低溫寡照、多陰雨，導(dǎo)致苗床滋生多種病害，其中報道較多的病害有煙草猝倒病[3-5]、煙草立枯病[6]、煙草黑脛病[7]、煙草枯萎病[8]、煙草灰霉病[9]等。大部分苗期病害為根莖性病害，其病原菌來源于育苗基質(zhì)、漂盤、煙草種子、育苗用水等育苗物資或環(huán)境，其中育苗基質(zhì)為主要來源。關(guān)于苗期基質(zhì)病原菌的檢測雖有報道，但主要集中在單個病原菌的檢測上[10]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，不同生境下的微生物群落結(jié)構(gòu)被逐漸認(rèn)知，包括煙草根圍[11-12]、大田期煙葉葉際[13]、種子[14]及烘烤期煙葉葉際[15-16]的微生物?！狙芯壳腥朦c】關(guān)于苗期煙株患感病前后根圍基質(zhì)的微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性變化卻鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，采用高通量測序技術(shù)對烤煙苗期患感病及健康煙苗根圍基質(zhì)進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析，旨在揭示煙苗患感病前后微生物群落的變化情況，為指導(dǎo)煙草苗期病害的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙草 供試煙草品種為云煙87，是貴州省主栽烤煙品種。該品種于2021年2月15日播種于貴州省興義市煙草育苗工廠，煙株田間管理按照標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)方式進(jìn)行管理。

1.1.2 主要試劑 基質(zhì)基因組DNA提取試劑盒購，購自天根生化科技有限公司；GeneJET膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒，均購自Thermo Scientific公司。

1.2 樣品采集

2021年4月在貴州省興義市煙草基地進(jìn)行樣品采集。隨機選取5株感病煙苗(莖基部有褐色病斑且邊緣明顯，受害部有干枯縊縮的現(xiàn)象)和5株健康煙苗，將煙苗整株拔起，輕輕抖落并收集須根周圍的基質(zhì)，兩組樣品分別編號JZT(感病)和JZCK(健康)感病樣品依次編號為JZT1、JZT2、JZT3、JZT4和JZT5，健康樣品依次編號為JZCK1、JZCK2、JZCK3、JZCK4和JZCK5。樣品收集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實驗室放置于-80℃超低溫冰箱保存，備用。

1.3 感病煙苗與健康煙苗根圍基質(zhì)微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

采用基質(zhì)基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基質(zhì)微生物基因組DNA的提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的質(zhì)量。將提取的DNA置于離心管中，并用無菌水稀釋至濃度為1 ng/μL，以此為模板，使用引物ITS1-5F-F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS1-1F-R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)、515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)分別對基質(zhì)真菌ITS1區(qū)域與細(xì)菌V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：Phusion?高保真酶(New England Biolabs)15 μL，上游、下游引物各0.2 μmol/L，模板DNA 10 ng。PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，使用GeneJET膠回收試劑盒回收純化產(chǎn)物，之后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒構(gòu)建文庫，文庫經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后在Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照劉暢等[13，17]的方法對后續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括樣品的Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析(PCA分析[18]、ANOSIM分析)、物種組成、功能預(yù)測分析等，此過程均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序深度

如圖1所示，在序列數(shù)達(dá)到30 000個時，所有樣品的稀釋曲線開始趨于平緩。當(dāng)序列數(shù)達(dá)到40 000個時，稀釋曲線已趨于飽和，表明此次測序深度已經(jīng)覆蓋樣品絕大多數(shù)物種，足以反映樣品的物種多樣性。

圖1 感病煙苗與健康煙苗根圍基質(zhì)細(xì)菌(A)和真菌(B)擴(kuò)增子測序稀釋曲線

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控

通過對Reads剪切過濾，對于細(xì)菌群落來說，平均每個樣品測得82 091條原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過質(zhì)控平均得到77 890條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效率達(dá)95.2%。通過與數(shù)據(jù)庫Silva132比對，進(jìn)行物種注釋，并對不同分類層級統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：共有2 057個OTUs，其中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為2 057個(100.0%)，注釋到界、門、綱、目、科、屬和種水平的比例分別為100.0%、96.3%、91.5%、81.8%、72.6%、51.5%和11.4%。對于真菌群落，平均每樣品測得74 614條reads，經(jīng)過質(zhì)控平均得到72 881條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效率達(dá)97.7%。通過與數(shù)據(jù)庫UNITE比對發(fā)現(xiàn)：共有998個OTUs，其中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為927(92.9%)，注釋到界、門、綱、目、科、屬和種水平的比例分別為92.9%、44.3%、37.3%、36.1%、32.2%、28.2%和17.5%。

2.3 感病苗與健康苗根圍基質(zhì)微生物群落Alpha多樣性

如表1所示，根圍基質(zhì)微生物群落的覆蓋度指數(shù)為0.996～0.998，表明本次測序的數(shù)據(jù)合理，能真實、合理地反映微生物群落的多樣性。健康苗根圍基質(zhì)(JZCK)微生物群落的Alpha多樣性指數(shù)(Shannon、Chao1、ACE指數(shù))均高于感病苗根圍基質(zhì)(JZT)，經(jīng)LSD檢測感病苗與健康苗根圍基質(zhì)的細(xì)菌與真菌群落的Alpha多樣性指數(shù)間均無顯著性差異。

表1 感病煙苗與健康煙苗根圍基質(zhì)微生物Alpha多樣性指數(shù)(種水平)

2.4 感病煙苗與健康煙苗根圍基質(zhì)微生物群落特征

由圖2可見，在門水平，所有樣品的細(xì)菌主要分布在變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，其中，JZT的變形菌門相對豐度顯著高于JZCK，JZCK的擬桿菌門相對豐度顯著高于JZT。在屬水平，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質(zhì)相對豐度排名前10的優(yōu)勢屬(相對豐度>1%)為未分類的藍(lán)細(xì)菌(unidentified Cyanobacteria)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘脂單胞菌屬(Sphingopyxis)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、柄桿菌屬(Caulobacter)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、Pseudolabrys、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)和Reyranella，其中JZCK的地桿菌屬(Pedobacter)和Terrimons相對豐度顯著高于JZT。感病煙苗根圍基質(zhì)(JZT)特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬(>1%)為Dongia、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和纖維菌屬(Cellulomonas)，健康煙苗根圍基質(zhì)(JZCK)特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬(>1%)為Terrimonas、地桿菌屬(Pedobacter)和Romboutsia。原始測序數(shù)據(jù)均上傳至GenBank(BioProject ID：PRJNA752815；Biosample accession：SUB10169531)。

注：表示感病與健康煙苗基質(zhì)微生物在P<0.05水平的差異顯著性。下同。

由圖3A可見，在門水平，所有樣品的真菌主要分布于子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和隱真菌門(Rozellomycota)，其中JZT2中的擔(dān)子菌門相對豐度遠(yuǎn)高于其他樣品。由圖3B可見，在屬水平，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質(zhì)均有的優(yōu)勢屬(豐度>1%)為金孢子菌屬(Chrysosporium)和假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)，其中JZCK的Psiloglonium相對豐度顯著高于JZT。感病煙苗根圍基質(zhì)(JZT)特有的優(yōu)勢屬為錐毛殼屬(Coniochaeta)、螺菌屬(Neobulgaria)、絲衣霉屬(Byssochlamys)、曲霉屬(Aspergillus)和Pseudeurotium，其中JZT2的亡革菌屬(Thanatephorus)的相對豐度可達(dá)91.9%，亡革菌屬屬于擔(dān)子菌門，健康煙苗根圍基質(zhì)(JZCK)特有的優(yōu)勢真菌屬(>1%)為節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)。原始測序數(shù)據(jù)均上傳至GenBank(BioProject ID：PRJNA752729；Biosample accession：SUB10

圖3 感病與健康煙苗根圍基質(zhì)中真菌在門(A)、屬(B)水平的群落組成

2.5 感病與健康煙苗根圍基質(zhì)微生物群落結(jié)構(gòu)差異

如圖4所示，經(jīng)PCA分析，在細(xì)菌群落方面，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質(zhì)細(xì)菌分布相對緊密，表明感病(JZT)與健康(JZCK)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)相似，PC1和PC2對群落結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)值分別為26.38%和15.96%。在真菌群落方面，感病(JZT)與健康(JZCK)分布相對分散，表明罹病(JZT)與健康(JZCK)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，PC1和PC2群落結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)值分別為20.09%和17.2%。

圖4 罹病與健康煙苗根圍基質(zhì)細(xì)菌(A)和真菌(B)的PCA分析

2.6 真菌與細(xì)菌群落差異

如圖5所示，真菌與細(xì)菌群落的R值均大于0，說明組內(nèi)差異小于組間差異。在細(xì)菌群落中，P值大于0.05，JZCK與JZT間無顯著差異；在真菌群落中，P值小于0.05，表明JZCK與JZT分組間存在顯著性差異。

圖5 感病與健康煙苗根圍基質(zhì)中細(xì)菌(A)和真菌(B)的ANOSIM分析

2.7 代謝功能

如圖6A所示，感病與健康煙苗根圍基質(zhì)中細(xì)菌在一級代謝功能層主要分布于6類代謝通路：代謝類(Metabolism)、環(huán)境信息處理類(Environmental information processing)、遺傳信息處理類(Genetic information processing)、細(xì)胞過程類(Cellular processes)、人類疾病類(Human diseases)和有機系統(tǒng)類(Organismal systems)，其中代謝類在感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質(zhì)細(xì)菌群落中相對豐度最高，其次為環(huán)境信息處理類和遺傳信息處理類，有機系統(tǒng)類豐度最低。

在二級代謝功能層上(圖6B)，整體來說，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質(zhì)細(xì)菌主要分布于35類代謝通路，其中兩者分布于新陳代謝類的細(xì)菌種類最多，功能從強到弱(>1%)的依次為氨基酸代謝(Amino acid metabolism，10.5%～11.0%)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism，9.8%～10.3%)、能量代謝(Energy metabolism，5.1%～6.1%)、異生素代謝和降解(Xenobiotics biodegradation and metabolism，3.7%～4.6%)、輔酶和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins，3.9%～4.3%)、脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism，3.6%～4.0%)、核苷酸代謝(Nucleotide metabolism，2.9%～3.3%)、代謝(Metabolism，2.4%～2.5%)、萜類化合物和聚酮化合物代謝(Metabolism of terpenoids and polyketides，2.0%～2.2%)、其他氨基酸代謝(Metabolism of other amino acids，2.0%～2.2%)、酶家族(Enzyme families，1.6%～1.9%)和聚糖生物合成和代謝(Glycan biosynthesis and metabolism，1.6%～1.8%)。

注：A, L1水平的KEGG功能相對豐度。B, L2水平的KEGG功能聚類熱圖。C, FUNGuild功能相對豐度。

苗期基質(zhì)真菌經(jīng)FUNGuild功能預(yù)測分析(圖6C)，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗根圍基質(zhì)真菌主要分布于25個生態(tài)功能群，不同樣品之間功能組成相似，但優(yōu)勢功能群所占比例有所差異。健康煙苗根圍基質(zhì)(JZCK)中未定義腐生菌(Undefined saprotroph，7.1%)相對豐度最高，其次為未定義腐生-木腐生菌(Undefined saprotroph-wood saprotroph，3.4%)和動物病原-基質(zhì)腐生菌(Animal pathogen-substrate saprotroph，1.1%)。感病煙苗根圍基質(zhì)(JZT)中植物病原菌(Plant pathogen，19.2%)相對豐度最高，其次為未定義腐生菌(Undefined saprotroph，12.4%)、未定義腐生-木腐生菌(Undefined saprotroph-wood saprotroph，8.8%)、動物病原-糞腐生-內(nèi)生-植物病原-未定義腐生菌(Animal pathogen-dung saprotroph-endophyte-plant pathogen-undefined saprotroph，5.8%)和動物病原-基質(zhì)腐生菌(Animal pathogen-substrate saprotroph，2.4%)。

3 討論

在物種組成上，感病與健康煙苗根圍基質(zhì)微生物的組成和豐度具有明顯差異。在細(xì)菌群落方面，在門水平上，感病(JZT)與健康(JZCK)煙苗基質(zhì)優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，與向立剛等[12]對健康與感染黑脛病煙株根際基質(zhì)細(xì)菌群落研究的優(yōu)勢細(xì)菌門結(jié)果類似。感病后，變形菌門豐度顯著上升，變形菌門中包含大量的動植物病原菌[19]，其相對豐度的顯著升高，可能引起植株的抗逆性減弱，發(fā)病率上升的情況。在屬水平上，感病與健康煙苗基質(zhì)優(yōu)勢細(xì)菌屬均為未分類的藍(lán)細(xì)菌、德沃斯氏菌屬、假單胞菌屬等，與向立剛等[12]對健康與感染黑脛病煙株根際基質(zhì)細(xì)菌群落研究的優(yōu)勢細(xì)菌屬結(jié)果差異較大，可能原因是兩者取樣基質(zhì)來源不同引起。感病煙苗根圍基質(zhì)中德沃斯氏菌屬和假單胞菌屬豐度分別高出2.3%和1.6%。德沃斯氏菌屬為固氮共生菌[20]，假單胞菌屬的Pseudomonassyringaepv.tabaci和Pseudomonassyringaepv.angulata分別為煙草野火病和細(xì)菌性角斑病的致病菌[7]，苗期基質(zhì)發(fā)現(xiàn)的假單胞菌屬中是否含有上述2種煙草致病菌有待進(jìn)一步研究。在真菌群落方面，在門水平上，感病與健康煙苗基質(zhì)優(yōu)勢真菌門為子囊菌門、擔(dān)子菌門和羅茲菌門，與向立剛等[11]黑脛病感染對根際基質(zhì)真菌群落研究的優(yōu)勢菌門基本一致。在屬水平上，感病煙苗根圍基質(zhì)金孢子屬與假裸囊菌屬明顯偏高，金孢子屬為基質(zhì)常見的腐生真菌[21]，推測煙苗發(fā)病后，其生長環(huán)境和營養(yǎng)條件適宜菌群定殖及生長。此外，在感病煙苗根圍基質(zhì)上發(fā)現(xiàn)了特有的優(yōu)勢真菌曲霉屬和亡革菌屬(JZT2中占比達(dá)91.9%)，曲霉屬為基質(zhì)和土壤中廣泛存在的腐生菌，亡革菌屬的Thanatephoruscucumeris為苗期煙草立枯病的病原菌，推測該研究取樣的感病煙苗中可能存在感立枯病的煙苗，同時煙苗發(fā)病后，環(huán)境中的曲霉菌在罹病組織上獲得繁殖?；?6s RNA和ITS的高通量測序技術(shù)能夠較好的分析育苗基質(zhì)中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，然而，該技術(shù)不能擴(kuò)增包括煙草腐霉、黑脛病菌在內(nèi)的多種卵菌病原菌。為此，針對煙草育苗期常出現(xiàn)的卵菌病害，下一步有待采用卵菌選擇性培養(yǎng)基或開發(fā)基于高通量測序的卵菌群落結(jié)構(gòu)分析技術(shù)進(jìn)行苗期卵菌病害的檢測。

高通量測序技術(shù)既可揭示苗期微生物的群落結(jié)構(gòu)，同時也可根據(jù)獲得微生物的相對豐度對其環(huán)境微生物的功能進(jìn)行預(yù)測。該研究發(fā)現(xiàn)，感病與健康煙苗根圍細(xì)菌主要分布于代謝類，據(jù)報道寡養(yǎng)單胞菌屬可以產(chǎn)生生長激素，促進(jìn)根的生長發(fā)育[22]，德沃斯氏菌屬和柄桿菌屬可以進(jìn)行固氮作用[20,23]，含鞘氨醇盒菌可以促進(jìn)基質(zhì)的降解[24]。這可能與苗期基質(zhì)含腐熟或未腐熟的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，需要通過細(xì)菌的降解轉(zhuǎn)化為煙苗生長能利用的營養(yǎng)物質(zhì)。真菌FUNGuild預(yù)測發(fā)現(xiàn)，感病與健康煙苗根圍基質(zhì)中均含有大量的腐生菌，腐生菌為基質(zhì)中的常見菌屬，結(jié)果與李朋發(fā)等[25]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

采用第二代高通量測序技術(shù)對感病與健康煙苗根圍基質(zhì)微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析發(fā)現(xiàn)，根圍基質(zhì)微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其類群組成與煙苗感病與否密切相關(guān)。健康煙苗根圍基質(zhì)真菌和細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)均高于感病煙苗根圍基質(zhì)；感病基質(zhì)的植物病原菌類群較健康基質(zhì)多。