李勝利

(修武縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 河南 修武 454350)

0 引言

【研究意義】葉綠素是大豆葉片進(jìn)行光合作用時(shí)吸收利用光能的主要物質(zhì)，葉綠素含量的高低直接影響大豆葉片光合能力、光合產(chǎn)物積累和最終產(chǎn)量的形成，可以作為大豆養(yǎng)分水平和生長(zhǎng)發(fā)育狀況的指示器[1-2]。傳統(tǒng)的葉綠素含量測(cè)定方法有實(shí)驗(yàn)室試劑法和葉綠素儀測(cè)定法，實(shí)驗(yàn)室試劑法一般耗時(shí)耗力，且對(duì)樣本具有一定的破壞性[3]。葉綠素儀測(cè)定法雖測(cè)定簡(jiǎn)單，但只能測(cè)定葉片上某個(gè)點(diǎn)的葉綠素相對(duì)值[4]。對(duì)大豆葉綠素含量進(jìn)行準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)和無損傷監(jiān)測(cè)，以精確掌握大豆養(yǎng)分水平和生長(zhǎng)發(fā)育狀況，實(shí)現(xiàn)大豆生長(zhǎng)過程的合理施肥和精準(zhǔn)管理意義重大。【前人研究進(jìn)展】近年來，因高光譜成像技術(shù)集合光譜與圖像二者的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)包含被測(cè)物體一維的高光譜反射信息和二維的空間位置信息，高光譜技術(shù)與成像技術(shù)結(jié)合，為高光譜探測(cè)目標(biāo)的圖像分類與定量估測(cè)模型的構(gòu)建與代入提供條件[5-7]?；诟吖庾V成像技術(shù)和不同的圖像分類方法，在煙葉與雜物的分類識(shí)別[8]、不同花生品種分類[9]和牧草種類識(shí)別[10]等方面獲得較好效果。利用作物的光譜反射特性，孫紅等[11]選用馬鈴薯葉片的高光譜成像數(shù)據(jù)中382～1 019 nm波段作為研究波段，利用隨機(jī)蛙跳算法和偏最小二乘法，選擇敏感波段并構(gòu)建馬鈴薯葉片葉綠素含量估測(cè)模型。丁希斌等[12]采用高光譜成像技術(shù)預(yù)測(cè)了油菜葉片的葉綠素含量，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.834。作物生長(zhǎng)參數(shù)估測(cè)模型代入高光譜成像數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)含量分布可視化方面，前人已經(jīng)在作物受病害程度、葉片水分含量和葉綠素含量等方面進(jìn)行研究，通過偽彩色處理技術(shù)，對(duì)作物生長(zhǎng)參數(shù)分布具有較直觀的展示[4,13-14]。大豆作為主要的糧油作物，基于光譜分析技術(shù)對(duì)大豆葉片葉綠素含量的無損監(jiān)測(cè)研究較少?？拙S平等[15]利用便攜式葉綠素測(cè)定儀和FieldSpec 3地物光譜儀(350～1 000 nm)對(duì)大豆葉片葉綠素含量進(jìn)行估測(cè)，且估測(cè)模型具有較高的精度和良好的預(yù)測(cè)能力。宋開山等[16]測(cè)定大豆冠層反射光譜和葉綠素?cái)?shù)據(jù)，使用不同建模方法對(duì)葉綠素含量進(jìn)行估測(cè)發(fā)現(xiàn)，基于小波分析的回歸模型具有較好的估測(cè)效果?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】大豆葉片葉綠素含量多數(shù)研究是基于便攜式光譜儀采集的數(shù)據(jù)，并未使用高光譜成像技術(shù)采集數(shù)據(jù)，不能實(shí)現(xiàn)大豆葉綠素含量、元素營(yíng)養(yǎng)水平和生長(zhǎng)發(fā)育狀況差異性的直觀展示?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選擇葉綠素含量具有代表性的大豆葉片，采集其高光譜成像數(shù)據(jù)和葉綠素含量值，通過形式簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)和具有生理生化意義的植被指數(shù)作為光譜變量構(gòu)建大豆葉片葉綠素含量估測(cè)模型，結(jié)合大豆葉片高光譜成像數(shù)據(jù)，計(jì)算高光譜圖像上每一像素點(diǎn)的葉綠素含量值，利用偽彩色圖像處理技術(shù)繪制大豆葉片葉綠素含量分布圖，為直觀監(jiān)測(cè)大田的大豆冠層元素營(yíng)養(yǎng)水平和生長(zhǎng)發(fā)育狀況提供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆品種為黃淮海地區(qū)常見品種齊黃34，種子來源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 大豆栽培與葉片采摘

大豆于2020年6月播種于河南省修武縣農(nóng)技推廣中心大豆示范中心，按照當(dāng)?shù)胤N植習(xí)慣進(jìn)行田間管理，保證大豆樣本與當(dāng)?shù)卣４蠖怪仓晟L(zhǎng)水平一致。在大豆初花期和鼓粒期，肉眼觀察大豆葉片葉色和發(fā)育程度，采摘葉色和發(fā)育程度差異較大的大豆葉片，為避免葉片失水采摘后立即放入冷藏盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行高光譜圖像信息及葉綠素含量的采集與測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 大豆葉片高光譜圖像信息采集 利用Pika XC高光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行高光譜圖像信息采集，該系統(tǒng)主要由電控位移平臺(tái)、高光譜相機(jī)、光源、標(biāo)準(zhǔn)白板和計(jì)算機(jī)等部件組成，結(jié)構(gòu)如圖1所示。高光譜相機(jī)的光

圖1 高光譜成像系統(tǒng)

譜分辨率為2.8 nm，采樣間隔為1.6 nm，光譜為400～1 000 nm，通過線性掃描的方式進(jìn)行高光譜圖像信息采集。首先開啟系統(tǒng)和光源，預(yù)熱20 min，以消除基線漂移的影響，調(diào)整相機(jī)鏡頭與電控位移平臺(tái)的垂直距離約為45 cm。然后通過軟件加載高光譜相機(jī)與電控位移平臺(tái)，調(diào)整平臺(tái)位置，使鏡頭對(duì)準(zhǔn)樣本掃描初始位置，進(jìn)行曝光、暗電流采集、白板校正和圖像寬高比調(diào)節(jié)等工作。最后對(duì)大豆葉片進(jìn)行高光譜成像數(shù)據(jù)采集，每次采集完成后均需重新進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)白板校正，利用公式(1)計(jì)算大豆葉片的高光譜成像數(shù)據(jù)。

(1)

式中，Iraw為樣本葉片未經(jīng)校正的高光譜數(shù)據(jù)，Iwhite為白板數(shù)據(jù)，Idark為暗電流數(shù)據(jù)，R為校正過后的大豆葉片高光譜成像數(shù)據(jù)。

1.3.2 大豆葉片葉綠素含量 大豆葉片葉綠素含量測(cè)定參考張憲政[17]的方法，大豆葉片高光譜成像數(shù)據(jù)采集完成后，立即使用直徑為1.5 cm的打孔器在主葉脈兩側(cè)兩孔并稱量孔重，剪為細(xì)絲狀后放入20 mL 80%丙酮溶液中，在20℃下黑暗浸提1 d，直至大豆葉片葉色完全變白，測(cè)定溶液在663 nm和645 nm處的光密度，利用計(jì)算公式(2)和(3)計(jì)算的葉綠素含量作為該大豆葉片樣本的葉綠素含量。

Chlt=20.21A645+8.02A663

(2)

(3)

式中，A663和A645分別表示波長(zhǎng)663 nm和645 nm的吸光度，Chlt表示葉綠素濃度(mg/L)，C表示葉綠素質(zhì)量濃度(mg/L)，V表示提取液的體積(mL)，W表示葉片重(g)，LCC(mg/L)表示葉片葉綠素濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 訓(xùn)練集與預(yù)測(cè)集的選擇 采用濃度梯度法[18]在大豆葉片總樣本中，按葉綠素含量高低順序排列，每隔3個(gè)樣本抽取1個(gè)大豆葉片樣本作為預(yù)測(cè)集，剩余大豆葉片樣本作為訓(xùn)練集。

1.4.2 大豆葉片高光譜反射率的獲取 大豆葉片樣本進(jìn)行高光譜成像數(shù)據(jù)采集完成后，在ENVI 5.3中以整張大豆葉片作為感興趣區(qū)域(Region Of Interest，ROI)，對(duì)ROI上每一像素點(diǎn)上的反射光譜進(jìn)行平均處理，作為該大豆葉片樣本的反射光譜。

1.4.3 植被指數(shù) 植被指數(shù)作物高光譜遙感估測(cè)模型中最常用的光譜參量，其特質(zhì)為形式簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)和具有一定的生理生化意義。如表1所示，一是引用前人研究中與葉綠素含量相關(guān)性較強(qiáng)的植被指數(shù)；二是構(gòu)建400～1 000 nm內(nèi)各波段光譜反射率兩兩自由組合的差值植被指數(shù)(Difference Vegetation Index，DVI)、比值植被指數(shù)(Ratio Vegetation Index，RVI)和歸一化植被指數(shù)

表1 植被指數(shù)的計(jì)算公式

(Normalized Difference Vegetation Index，NDVI)，計(jì)算構(gòu)建的自由組合植被指數(shù)與葉綠素含量的相關(guān)性，通過二者相關(guān)性的強(qiáng)弱確定所需要的自由組合植被指數(shù)。3種自由組合植被指數(shù)的計(jì)算公式如下：

DVI(i,j)=Ri+Rj

(4)

(5)

(6)

式中，R表示原始光譜反射率或一階導(dǎo)數(shù)光譜值，i和j表示波長(zhǎng)(nm)，Ri和Rj表示在波長(zhǎng)i或j波長(zhǎng)的原始光譜反射率或一階導(dǎo)數(shù)光譜值。

1.4.4 估測(cè)模型的構(gòu)建與檢驗(yàn) 通過訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)構(gòu)建大豆葉片葉綠素含量估測(cè)模型，并利用預(yù)測(cè)集樣本數(shù)據(jù)對(duì)估測(cè)模型進(jìn)行精度評(píng)價(jià)。通過引用前人植被指數(shù)(表1)與自由組合植被指數(shù)分別和葉綠素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，根據(jù)相關(guān)性的大小參與葉綠素含量估測(cè)模型的構(gòu)建，主要以線性和二次回歸方程對(duì)植被指數(shù)和葉綠素含量進(jìn)行擬合，擬合方程如下：

線性函數(shù)：y=αx+b

二次函數(shù)：y=αx2+bx+c

對(duì)估測(cè)模型優(yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有決定系數(shù)R2(Determination Coefficients)和均方根誤差RMSE(Root Mean Square Errors)，其中訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的決定系數(shù)分別為R2c和R2p。R2的值介于0～1，當(dāng)R2的值越接近1且RMSE越接近0時(shí)，表明模型的預(yù)測(cè)效果越佳，精度越高。R2和RMSE計(jì)算公式如下：

(7)

(8)

式中，yi代表預(yù)測(cè)值，yj代表實(shí)測(cè)值，n代表樣本數(shù)。

1.4.5 大豆葉片葉綠素含量可視化分布 大豆葉片葉綠素含量分布可視化的原理是利用高光譜成像數(shù)據(jù)和含量估測(cè)模型實(shí)現(xiàn)葉綠素含量在對(duì)應(yīng)空間位置的數(shù)字化顯示，主要包括目標(biāo)樣本圖像分割和含量可視化兩部分。

1) 目標(biāo)對(duì)象圖像分割。目標(biāo)樣本圖像分割是將高光譜成像數(shù)據(jù)中大豆葉片與背景的光譜信息與空間信息進(jìn)行分割，獲得只包含大豆葉片的信息。在ENVI 5.3中利用支持向量機(jī)技術(shù)，以大豆葉片與背景的光譜特征不同作為支持向量機(jī)技術(shù)的分類標(biāo)準(zhǔn)，輸出二者的分類結(jié)果，然后通過矢量變換和掩模等步驟輸出只包含大豆葉片的高光譜成像數(shù)據(jù)。

2) 含量可視化。通過大豆葉片葉綠素含量估測(cè)模型和高光譜成像數(shù)據(jù)，計(jì)算大豆葉片高光譜圖像上每個(gè)像素點(diǎn)的葉綠素含量值，此時(shí)大豆葉片高光譜圖像變換為含位置信息的葉綠素含量分布灰度圖，按灰度圖各位置的灰度值進(jìn)行偽彩色處理，最終獲得葉綠素在大豆葉片上的含量可視化分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 訓(xùn)練集與預(yù)測(cè)集的葉綠素含量分布

由表2可見，訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集中大豆葉片的葉綠素平均含量分別為2.513 mg/g和 2.591 mg/g，變異系數(shù)分別為31.8%和30.6%。

表2 訓(xùn)練集與預(yù)測(cè)集的葉綠素含量分布

2.2 大豆葉片反射光譜曲線

由圖2可見，由于葉綠素的強(qiáng)反射作用，在540 nm左右的綠光范圍形成“綠峰”；葉綠素對(duì)670 nm左右的紅光具有強(qiáng)吸收作用，形成“紅谷”；葉綠素對(duì)紅光強(qiáng)吸收和葉片復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)近紅外光的多次強(qiáng)反射，導(dǎo)致在波長(zhǎng)680～760 nm內(nèi)產(chǎn)生1條反射率急劇上升的斜邊，稱為紅邊。大豆葉片反射光譜中的綠峰、紅谷和高反射率平臺(tái)的反射率值和紅邊的波段位置差異顯著，表明選擇的訓(xùn)練集樣本具有良好的代表性，可以進(jìn)行大豆葉片葉綠素含量的高光譜估測(cè)研究。

圖2 大豆樣本葉片的反射光譜曲線

大豆葉片樣本按葉綠素含量(0.919～4.125 mg/g)的高低順序分為4組:0.919～1.720 mg/g、1.720～2.522 mg/g、2.522～3.323 mg/g和3.323～4.125 mg/g，進(jìn)行平均處理獲得不同葉綠素含量的大豆葉片反射光譜曲線(圖3)，隨著大豆葉片葉綠素含量的增加，“綠峰”反射率值下降明顯，680～760 nm的紅邊位置明顯向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，但高反射率平臺(tái)的反射率無顯著變化規(guī)律。

圖3 不同含量葉綠素的大豆葉片反射光譜曲線

2.3 大豆葉片葉綠素含量與反射光譜的關(guān)系

2.3.1 與反射光譜的相關(guān)性 如圖4所示，葉綠素含量與光譜反射率在各波段的相關(guān)性大小和顯著性不同，在400～424 nm和743～1 000 nm呈正相關(guān)，與425～742 nm呈負(fù)相關(guān)，二者在474～734 nm呈顯著負(fù)相關(guān)水平(P<0.05)，在486～731 nm呈極顯著負(fù)相關(guān)水平(P<0.01)，相關(guān)性最強(qiáng)的波段位于700 nm(r=-0.879)。

圖4 大豆葉片光譜反射率與葉綠素含量的相關(guān)性

2.3.2 與植被指數(shù)的相關(guān)性 如圖5所示，400～1 000 nm波段自由組合形成的DVI、RVI和NDVI與葉綠素含量間的相關(guān)系數(shù)具有沿對(duì)角線對(duì)稱分布的特點(diǎn)；3種自由組合形成的植被指數(shù)與葉綠素含量相關(guān)性強(qiáng)的光譜波段主要在490～760 nm的可見光區(qū)域，尤其分布在綠光(492～577 nm)和紅光(622～760 nm)范圍內(nèi)。

注：每個(gè)像素點(diǎn)的色度值代表構(gòu)建的植被指數(shù)與大豆葉片葉綠素含量相關(guān)系數(shù)的大小。

如表3所示，現(xiàn)葉綠素含量與植被指數(shù)的相關(guān)性均達(dá)極顯著水平(P<0.01)，引用的植被指數(shù)中PSRI與葉綠素含量的相關(guān)性最差(r=0.336)，m NDI與葉綠素含量的相關(guān)性最優(yōu)(r=0.905)，3種自由組合植被指數(shù)與葉綠素含量的相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，其中RVI (968,698)與葉綠素含量的相關(guān)性最好(r=0.923)。

表3 大豆葉片葉綠素含量與植被指數(shù)的相關(guān)性

2.4 大豆葉片葉綠素含量估測(cè)模型的構(gòu)建與檢驗(yàn)

表4 基于植被指數(shù)的大豆葉綠素含量估測(cè)模型

2.5 大豆葉片葉綠素含量的可視化

如圖6所示，葉綠素含量由下向上逐漸上升；由大豆葉片上不同顏色可知，成熟健康的大豆葉片中，葉綠素主要分布在葉脈兩側(cè)，葉綠素含量較高，在葉片邊緣和基部葉綠素含量較低，在衰老或損傷的葉片中，葉綠素主要集中在葉片未失綠的位置，在葉片失綠的位置含量較低。表明，基于高光譜成像技術(shù)的大豆葉片葉綠素含量可視化的分布情況符合事實(shí)規(guī)律，大豆葉片葉綠素含量分布可視化效果較好。

注：A為大豆葉片高光譜圖像，B為大豆葉片與背景分割圖像，C為大豆葉片葉綠素含量分布可視化圖像；右側(cè)色度條中不同顏色對(duì)應(yīng)不同的葉綠素含量，隨著數(shù)值增大色度條顏色由藍(lán)色漸變?yōu)榧t色。

3 討論

作物葉片反射光譜特征包括藍(lán)谷、紅谷、綠峰、高反射率平臺(tái)、紅邊和紅邊位置等，主要受到葉片葉綠素含量、水分含量和葉片結(jié)構(gòu)等因素綜合影響[24-25]。該研究中隨著大豆葉片葉綠素含量的增加，“綠峰”反射率明顯下降，紅邊位置發(fā)生“紅移”，表明葉綠素對(duì)可見光具有強(qiáng)吸收作用，高反射率平臺(tái)反射率并沒有發(fā)生明顯有規(guī)律的變化，高反射率平臺(tái)的差異主要與葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)、葉片厚度和內(nèi)部組織有關(guān)，表明葉片葉綠素含量與葉片結(jié)構(gòu)之間沒有明顯聯(lián)系[26-29]。該研究中直接對(duì)原始光譜反射率和葉綠素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，并未對(duì)原始反射光譜進(jìn)行預(yù)處理變換，前人研究表明，對(duì)原始反射光譜進(jìn)行預(yù)處理變換，如一階導(dǎo)數(shù)變換、連續(xù)小波變換、標(biāo)準(zhǔn)正太變量變換和移動(dòng)平均法等光譜預(yù)處理方法，可以減弱外界因素的干擾并增強(qiáng)光譜反射特征[30-31]。

大豆葉片葉綠素含量與植被指數(shù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量與波段反射率自由組合植被指數(shù)的相關(guān)性優(yōu)于引用的前人植被指數(shù)[19-23]，可能因?yàn)橹脖恢笖?shù)具有明顯的時(shí)效性和空間差異性，受環(huán)境、作物種類和觀測(cè)尺度等因素影響，所以基于自身反射光譜數(shù)據(jù)構(gòu)建的植被指數(shù)與葉綠素含量的相關(guān)性更強(qiáng)[32]。該研究采用植被指數(shù)作為光譜參量通過線性和二次方程構(gòu)建葉綠素含量估測(cè)模型表明，其他光譜參量如光譜面積和紅邊位置等，與作物農(nóng)學(xué)參數(shù)含量、生理參數(shù)和產(chǎn)量品質(zhì)之間同樣具有較強(qiáng)的相關(guān)性，紅邊位置的“紅移”和“藍(lán)移”也常用作估測(cè)作物的氮素營(yíng)養(yǎng)水平[33-34]。另有研究表明，采用逐步回歸、偏最小二乘和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等建模方法的建模效果優(yōu)于簡(jiǎn)單的線性和二次方程建模方法[35-36]。

該研究中，基于大豆葉片高光譜圖像和葉綠素含量估測(cè)模型，基本實(shí)現(xiàn)葉綠素在大豆葉片上含量可視化分布，可以較為直觀的反映葉綠素在大豆葉片分布情況。在葉片某些區(qū)域葉綠素含量的可視化分布情況不合理，這主要由于大豆葉片表面不平整，造成葉片不同位置距離鏡頭的距離不一致，當(dāng)光源照射后，這些位置存在模糊、過曝和陰影等問題，導(dǎo)致不同位置的光譜反射率有差異或失真。另外，大豆葉片不同位置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同，可在對(duì)應(yīng)的反射光譜中體現(xiàn)，因而通過估測(cè)模型預(yù)測(cè)的葉綠素含量具有差異。該研究是在葉片觀測(cè)水平對(duì)大豆進(jìn)行葉綠素含量的進(jìn)行可視化研究，雖在較高的冠層尺度、無人機(jī)尺度和衛(wèi)星尺度的觀測(cè)尺度下的大豆葉綠素含量可視化研究更具有實(shí)際意義，但葉片尺度上的可視化研究可為其他尺度的研究提供方法和思路。后續(xù)還需在其他生態(tài)點(diǎn)、更多品種和不同尺度進(jìn)行試驗(yàn)，利用多種光譜變量和建模方法完善改進(jìn)大豆葉片葉綠素含量估測(cè)模型，以期提高預(yù)測(cè)精度、增強(qiáng)普適性和實(shí)現(xiàn)跨尺度葉綠素含量估測(cè)。對(duì)基于高光譜成像數(shù)據(jù)的大豆葉片葉綠素含量分布可視化的步驟進(jìn)一步優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)效果更優(yōu)的葉綠素含量分布可視化視覺表達(dá)。

4 結(jié)論