符浩東 張晨曦 李奕霏 鄭永權(quán) 劉 陽,2,*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運管控重點實驗室，北京 100193；2 佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231；3 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是由鐮刀菌屬(Fusarium)合成的次級代謝產(chǎn)物間苯二酚酸內(nèi)酯，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌合成[1]。ZEN因廣泛污染玉米、大麥、小麥等作物及副產(chǎn)物而備受關注。最近在我國進行的一項調(diào)查顯示，超過70%的玉米樣品被ZEN污染[2]。ZEN在哺乳動物中表現(xiàn)出雌激素活性，可激活雌激素受體，導致動物出現(xiàn)生殖障礙，偶爾會導致人類的高雌激素綜合癥,危害動物和人體健康[3]。因此，為了解決食品安全問題，減少ZEN造成的經(jīng)濟損失，采用物理法、化學法或生物學方法來降解被污染飼料或谷物中的ZEN[4-6]。但在脫毒過程中，理化脫毒往往會改變食物和飼料的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，同時脫毒劑的使用可能對環(huán)境造成二次污染[7]。相比之下，生物脫毒具有很高的特異性，能對產(chǎn)品進行無害脫毒，甚至在適宜的條件下達到完全脫毒[8]。

生物技術在食品和飼料工業(yè)發(fā)展中具有巨大的潛力[9-10]。微生物產(chǎn)生的酶能更有效地轉(zhuǎn)化和降解天然食品中的ZEN，在食品加工中也有廣泛的應用[9]。目前有3種酶被認為可以降解ZEN：內(nèi)脂酶[11]、過氧化物酶[12]和漆酶[13]，其中過氧化物酶對ZEN的降解機制尚不清楚。漆酶主要用于去除黃曲霉毒素，但只有在正丁醇甲酯存在的條件下才能降解ZEN，極大限制了其工業(yè)應用的廣泛度[14]。漆酶具有高ZEN降解能力和明確的解毒機理。在2002年，Kakeya等[15]發(fā)現(xiàn)真菌粉紅黏帚霉(Clonostachysrosea)能夠降解ZEN。同年，Takahashi-Ando等[16]從粉紅黏帚霉Clonostachysrosea(別名Gliocladiumroseum)IFO7063中分離出ZEN解毒基因ZHD101。目前來自粉紅黏帚霉的ZEN降解酶基因zhd101、zlhy-6、ZEN-jjm等被成功克隆表達，重組蛋白均表現(xiàn)出較強的ZEN水解能力。zlhy-6降解酶基因與ZHD101有11個堿基的差異，由zlhy-6基因表達的重組降解酶對ZEN具有良好的降解能力，且降解后無ZEN殘留[17]。ZEN降解酶基因已在大腸桿菌[18]、啤酒酵母[16]、巴斯德畢赤酵母[17]和羅伊氏乳桿菌[19]中表達，然而目前有關ZEN降解酶在枯草芽孢桿菌中表達的研究報道較少。與大腸桿菌和畢赤酵母相比較，革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌是一種非致病性微生物，具有悠久的食品發(fā)酵歷史，并被公認為安全菌株(generally recognized as safe, GRAS)[20]。此外，芽孢桿菌還具有孢子多、抗逆性強、生產(chǎn)成本低、生長快以及分泌異源酶和蛋白質(zhì)的能力強，易于遺傳操作等優(yōu)點[21]。

因此，為了實現(xiàn)玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢桿菌中的表達，同時提高zlhy-6的表達，將枯草芽孢桿菌內(nèi)源性啟動子P43插入原質(zhì)粒啟動子下游，以期獲得雙啟動子表達質(zhì)粒；此外，為了克服質(zhì)粒不穩(wěn)定性和抗生素等不安全因素，利用同源重組的方法探索zlhy-6在枯草芽孢桿菌中的整合表達，旨在為實現(xiàn)玉米赤霉烯酮降解酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎，也為安全解決糧食儲藏和飼料生產(chǎn)中的ZEN污染提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和引物E.coliJM109 感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術有限公司；本試驗所用所有引物均由北京華大基因合成(表1)；枯草芽孢桿菌168菌株、pMA5質(zhì)粒、p7s6質(zhì)粒、pTSC質(zhì)粒，由江南大學江波老師課題組惠贈。

表1 本研究中使用的引物

1.1.2 試驗試劑 限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ)、DL5000 DNA標記、DL2000 DNA標記、Prime STAR Max、蛋白質(zhì)上樣緩沖液和DNA上樣緩沖液均購自日本TaKaRa公司；Blue Plus?蛋白標記(14～100 kDa)購自北京全式金生物技術有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自北京天根公司；His-tag蛋白純化試劑盒(抗變性)購自北京碧云天公司；ClonExpress? Ultra One Step Cloning Kit購自北京諾唯贊公司；氨芐青霉素、壯觀霉素、卡那霉素購自北京索萊寶。ZEN 標準品購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇(色譜級)購自美國 Fisher 公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DU800 紫外/可見分光光度計儀，美國Beckman Coulter公司；T100 PCR儀，美國Bio-Rad公司；1260 高效液相色譜儀，美國Agilent公司；SCIENTZ-950 超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；凝膠電泳儀，北京百晶生物技術有限公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；恒溫振蕩搖床，上海智誠公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮降解酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建 編碼粉紅黏帚霉G.roseum玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6(NCBI GenBank 登錄號：HQ825318)進行化學合成后，利用引物P1和P2進行PCR擴增。利用引物P3和P4從枯草桿菌168條染色體上擴增出枯草桿菌內(nèi)源性啟動子P43。利用引物P3和P2，通過重疊延伸PCR將P43啟動子和zlhy-6融合為表達盒。利用BamHⅠ對pMA5質(zhì)粒進行酶切，將酶切膠回收純化的載體和目的基因片段，通過一步克隆的方法進行酶連接，反應參照ClonExpress? Ultra One Step Cloning Kit說明書進行。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，用氨芐青霉素(50 μg·mL-1)篩選陽性克隆，測序獲得了含有單啟動子的表達載體pMA5-zlhy-6和含有雙啟動子的表達載體pMA5-P43-zlhy。

基于感受態(tài)細胞法[22]，將兩種重組質(zhì)粒導入枯草芽孢桿菌168，分別獲得兩種不同的重組枯草芽孢桿菌菌株168/pMA5-zlhy-6和168/pMA5-P43-zlhy。在含卡那霉素30 μg·mL-1的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，用菌落PCR方法鑒定陽性克隆。用菌落PCR方法鑒定陽性克隆，用無菌牙簽挑取單個菌落到PCR管中，加入20 μL水，100℃煮沸5 min。然后吸取2 μL上清作為模板進行PCR反應。體系為25 μL：Green Taq max 10 μL，上下游引物各1 μL，上清液2 μL，ddH2O 11 μL。菌落PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃解鏈30 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，共28個循環(huán)；72℃終延伸5 min。

1.3.2 重組質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性測定 重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性根據(jù)Nguyen等[23]的方法進行評估。將含有重組質(zhì)粒的細胞在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)約100代，包括多次傳代培養(yǎng)。將特定世代接種在LB平板(平板C)上，并將復制品接種在含30 μg·mL-1卡那霉素的LB平板(平板D)上。C板上的菌落數(shù)計為CC，D板上菌落數(shù)計為CD。CD/CC值表示重組質(zhì)粒在每一代培養(yǎng)中的穩(wěn)定性。2個平板均接種來自同一原代培養(yǎng)物的100個相同菌落。

1.3.3 玉米赤霉烯酮降解酶基因在枯草芽孢桿菌的整合表達 按照Shevchuk等[24]的方法，使用引物對P5/P6，通過PCR從p7S6載體中擴增出lox71-spc-lox66抗性基因表達盒。以枯草芽孢桿菌168條染色體為模板，以P7/P8 和P9/P10為引物，擴增淀粉酶同源臂片段amyE-back和amyE-front。此外，利用引物P2和P3從載體pMA5-P43-zlhy中擴增目標基因P43-zlhy，PCR產(chǎn)物按SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒的要求進行凝膠純化和提取。隨后，用Phusion高保真DNA聚合酶將4個DNA片段融合成一個完整的敲除片段，線性化的DNA片段轉(zhuǎn)化為枯草桿菌168的感受態(tài)細胞。用50 μg·mL-1壯觀霉素篩選，利用P11/P12引物進行菌落PCR鑒定，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。并通過兩步法(GM I，GM II)[25]，將篩選出的陽性重組子制備成感受態(tài)細胞。將質(zhì)粒pTSC轉(zhuǎn)化到上述感受態(tài)細胞中，然后利用IPTG(200 μmoL)誘導質(zhì)粒pTSC表達Cre重組酶。通過Cre重組酶誘導lox71位點和lox66位點之間發(fā)生同源重組，刪除壯觀霉素抗性標記。將溫度升高至51℃過夜，消除溫度敏感質(zhì)粒pTSC，從而獲得重組整合菌株BZ-zlhy。

1.3.4 ZEN降解酶的表達 采用搖瓶發(fā)酵法在枯草桿菌中表達ZEN降解酶。將重組菌株168/pMA5-zlhy-6、168/pMA5-P43-zlhy和BZ-zlhy接種至100 mL錐形瓶(10 mL LB +10 μL卡那霉素),37℃、200 r·min-1條件下過夜。第二天按3%接種量轉(zhuǎn)接至500 mL錐形瓶(100 mL LB+100 μL卡那霉素)。放入搖床中，37℃、200 r·min-1條件下進行擴大培養(yǎng)。在此過程中，測定OD600并繪制生長曲線。

1.3.5 ZEN降解酶的純化 在4℃條件下以8 000 r·min-1離心15 min后收獲重組細胞，洗滌2次，然后用含有100 mmol·L-1NaCl的50 mmol·L-1Tris/HCl(pH值7.5)重新懸浮。之后，在37℃條件下用20 mg·mL-1溶菌酶孵育細胞30 min，用超聲波破碎15 min(脈沖開啟2 s，脈沖關閉3 s)。以12 000×g離心20 min，除去未破碎的細胞和細胞碎片，并通過0.45 μm過濾器過濾上清液，得到粗酶溶液。粗酶溶液用His-tag 蛋白純化試劑盒純化，具體步驟按照His-tag蛋白純化試劑盒說明書進行。用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和分子量標記(14～100 kDa)測定粗酶和純化酶的分子量。

1.3.6 重組蛋白ZEN降解活性測定 將40 μL酶溶液、920 μL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值9.5)和40 μL ZEN標準儲備液(0.1 mg·mL-1)混合并在37℃下培養(yǎng)30 min，然后加入1 mL甲醇終止反應。用乙腈制備濃度為10、20、50、70和100 μg·mL-1的ZEN儲備標準溶液。ZEN的保留時間約為7 min。其他ZEN標準溶液也通過高效液相色譜法(high performance liguid chromatography, HPLC)檢測。記錄峰面積。以標準濃度為橫坐標，測得的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到的標準曲線符合y=5x的線性回歸方程，結(jié)果表明，ZEN濃度與色譜峰面積之間存在良好的線性關系。用ZEN標準曲線計算樣品中的ZEN含量。

ZEN降解率=[空白對照組ZEN濃度(μg·mL-1)-殘留ZEN濃度(μg·mL-1)]/空白對照組ZEN濃度(μg·mL-1)×100%。

酶活性定義：在37℃、pH值7.5條件下，以每分鐘降解1 μg ZEN所需的酶量為一個單位(U)。

1.3.7 ZEN的 HPLC 檢測條件 利用HPLC-FLD檢測ZEN毒素[17,25]，具體檢測條件為：安捷倫ZorbaxSB-C18柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，乙腈∶水(70∶30，v/v)作為流動相；流速1 mL·min-1，進樣體積 20 μL；激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 所有處理均設3次重復，使用Microsoft Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)整理與分析,應用Origin 2019b軟件完成制圖及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單啟動子和雙啟動子表達質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建質(zhì)粒的流程圖如圖1所示。本研究利用所描述的材料和方法構(gòu)建了目的質(zhì)粒，選擇大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體pMA5作為原載體。在原載體的基礎上，分別構(gòu)建了含有單啟動子的質(zhì)粒pMA5-zlhy-6和含有雙啟動子的質(zhì)粒pMA5-P43-zlhy。質(zhì)粒pMA5-zlhy-6含有1個強啟動子HapII，可以表達zlhy-6 基因。質(zhì)粒pMA5-P43-zlhy含有強啟動子HapII和枯草桿菌內(nèi)源性啟動子P43，其表達水平高于單啟動子質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草桿菌168感受態(tài)細胞中，用卡那霉素在LB瓊脂上篩選重組菌株168/pMA5-zlhy-6 和168/pMA5-P43-zlhy陽性克隆。最后，對篩選得到的陽性克隆進行克隆PCR鑒定，結(jié)果顯示重組菌株構(gòu)建成功。

圖1 單啟動子重組質(zhì)粒pMA5-zlhy和雙啟動子重組質(zhì)粒pMA5-P43-zlhy構(gòu)建示意圖

2.2 玉米赤霉烯酮降解酶基因在枯草芽孢桿菌的整合表達

枯草芽孢桿菌玉米赤霉烯酮降解酶基因染色體整合流程圖如圖2所示。在本研究中，P43-zlhy表達盒和lox71-spc-lox66標記盒夾在2個淀粉酶同源臂之間。將線性DNA片段直接轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌168個感受態(tài)細胞中，并用壯觀霉素篩選轉(zhuǎn)化子。由于zlhy-6基因表達盒和lox71-spc-lox66抗性基因表達盒被插入到染色體的淀粉酶位點中，通過雙交換事件發(fā)生染色體整合的重組菌將在帶有壯觀霉素的LB平板上生長。其他非復制性片段將隨宿主細胞的繁殖而丟失[26]。最后，通過Cre/Lox特異性重組系統(tǒng)敲除壯觀霉素抗性標記盒[27]，獲得無抗生素菌株BZ-zlhy。復制質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性是枯草桿菌表達系統(tǒng)的主要問題之一，使用整合質(zhì)?？梢杂行П苊膺@一問題。

注：實線為PCR產(chǎn)物，虛線為枯草芽孢桿菌染色體DNA。

2.3 重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

設置不同的時間梯度，測量野生型菌株和重組菌株的OD600值和酶活性(圖3)。以野生型作為陰性對照，每次試驗一式3份。結(jié)果表明，3株重組菌株生長趨勢一致(圖3-A)，但菌株168/pMA5-P43-zlhy具有較強的降解酶活性，尤其在18 h，168/pMA5-P43-zlhy酶活最高(2.2 U·mL-1)，而pMA5-zlhy-6和BZ-zlhy酶活分別為1.8 U·mL-1和0.4 U·mL-1(圖3-B)。結(jié)果表明兩個串聯(lián)的強啟動子，即在pMA5原始啟動子Hpa Ⅱ之后添加另一個強啟動子P43，可提高zlhy-6基因的表達水平和降解ZEN的酶活性?？芍?，重組枯草芽孢桿菌168/pMA5-P43-zlhy更適合表達zlhy-6基因。

2.4 zlhy-6的酶法測定和SDS-PAGE分析

通過SDS-PAGE分析由168/pMA5-zlhy-6、168/pMA5-P43-zlhy 和BZ-zlhy菌株表達的重組酶(圖4-A)。使用SDS-PAGE進行檢測，發(fā)現(xiàn)粗制酶和純化酶在約32 kDa處顯示出明顯的條帶，這和酶的理論分子量大小一致。同時發(fā)現(xiàn)，168/pMA5-P43-zlhy菌株表達的重組酶條帶最寬。說明3種菌株均可表達重組酶，并且168/pMA5-P43-zlhy菌株表達量最高。根據(jù)峰面積與ZEN濃度的關系計算，由168/pMA5-P43-zlhy菌株表達的ZLHY-6具有最高的ZEN降解率，為65.1%；BZ-zlhy菌株表達的ZLHY-6對 ZEN降解率最低，為12.8%；在168/pMA5-P43-zlhy中表達的ZLHY-6的酶活性為2.2 U·mL-1。

注：泳道M：預染蛋白梯(100、70、50、40、30、25和14 kDa)；泳道1：枯草芽孢桿菌168野生型(陰性對照)培養(yǎng)14 h后的上清液；泳道2：重組菌株168/pMA5-zlhy-6培養(yǎng)14 h后上清液；泳道3：重組菌株168/pMA5-P43-zlhy培養(yǎng)14 h后的上清液；泳道4：重組菌株BZ-zlhy培養(yǎng)14 h后上清液；泳道5：純化的酶。HPLC色譜法用于評估針對ZEN的zlhy-6酶活性。a：枯草芽孢桿菌168野生型細胞破碎后，將上清液與ZEN標準液孵育30 min，然后進行液相檢測。b：將BZ-zlhy細胞破碎后，將上清液與ZEN標準液孵育30 min，然后進行液相檢測。c：將 pMA5-zlhy-6細胞破碎后，將上清液與ZEN標準液孵育30 min，然后進行液相檢測。d：將pMA5-P43-zlhy細胞破碎后，將上清液與ZEN標準液孵育30 min，然后進行液相檢測。e：將純化的ZLHY-6蛋白與ZEN標準品孵育30 min，然后進行液相檢測。

2.5 重組質(zhì)粒穩(wěn)定性評價

原始的pMA5質(zhì)粒是一個分離不穩(wěn)定的質(zhì)粒，當質(zhì)粒以滾動圈復制時，產(chǎn)生單鏈DNA作為中間產(chǎn)物。表中的每個值都是三次獨立測試的平均值。表2顯示，含有該質(zhì)粒的重組菌株168/pMA5-zlhy-6在60代時質(zhì)粒穩(wěn)定性為87%，在第100代，質(zhì)粒的穩(wěn)定性為72%。隨著傳代次數(shù)的增加，重組質(zhì)粒分離穩(wěn)定值逐漸減小，說明質(zhì)粒在復制過程中丟失。而對于基因組整合表達的菌株BZ-zlhy，其遺傳信息在100代內(nèi)是完全穩(wěn)定的。

表2 重組質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性

3 討論

真菌毒素嚴重危害人畜健康，造成巨大的經(jīng)濟損失和不良社會影響[28]。為了解決真菌毒素污染，目前正在開發(fā)可以從農(nóng)產(chǎn)品中去除真菌毒素的方法[29]。物理和化學脫毒方法雖然取得了一定的成功，但存在操作困難、飼料營養(yǎng)品質(zhì)和適口性降低等缺點。與物理和化學脫毒方法相比，生物脫毒方法具有作用條件溫和、對原料感官特性和適口性影響最小、提高原料營養(yǎng)價值等優(yōu)點[30]。從技術角度看，酶催化方法具有特異性高、效率高的特點，在將真菌毒素轉(zhuǎn)化為低毒產(chǎn)品方面具有獨特的地位，保證了人類食品和動物飼料的最低污染和安全[31]。因此，生物技術方法在降低真菌毒素危害方面顯示出巨大潛力[9]。此外，前人對內(nèi)脂水解酶(如ZHD101、ZLHY-6、ZHD518、ZHDC和ZHDG)進行了充分的研究，分析了上述內(nèi)脂水解酶降解ZEN的能力，并證實了其化學結(jié)構(gòu)和代謝物的毒性較小[31]。

由于目前關于ZEN降解酶在枯草桿菌中表達的研究相對較少。因此，本研究旨在以ZLHY-6為例，探討高效表達脫毒酶的可行性。結(jié)果表明，ZLHY-6在發(fā)酵上清中的酶活為1.8 U·mL-1，低于文獻報道。例如，Xiang等[3]在畢赤酵母中表達ZHD時，酶活性為22.5 U·mL-1；王義春等[17]在畢赤酵母中表達了zlhy-6，酶活性達到10 U·mL-1。高蛋白表達水平通常可以通過強啟動子、目的基因的多拷貝、轉(zhuǎn)錄終止子和各種翻譯/分泌信號的最佳組合來實現(xiàn)[32]，其中啟動子是實現(xiàn)枯草芽孢桿菌外源基因高效表達的關鍵，研究人員在啟動子篩選方面進行了多次嘗試，許多研究表明雙啟動子可以顯著提高異源基因的表達水平[33]。張玲等[34]選用組成型啟動子PamyQ與PHpaII構(gòu)成的雙啟動子，有效地將胞外活性提高至31.24 U·mL-1，是單啟動子PHpaII的3.4倍。Kang等[35]在PHpaII啟動子下游串聯(lián)1個amyR2，用來表達4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶，與含單個PHpaII的枯草芽孢桿菌系統(tǒng)相比，含串聯(lián)啟動子的表達系統(tǒng)目的產(chǎn)物的產(chǎn)量分別提高11和12倍。本試驗為了提高表達水平，以枯草芽孢桿菌常用的強啟動子P43啟動子[36]和pMA5自身的啟動子HapII構(gòu)建雙啟動子。與單啟動子表達載體相比，酶活性提高了1.2倍。在37℃條件下，ZLHY-6對4 μg·mL-1ZEN的降解率在30 min內(nèi)達到65.1%，本研究對后續(xù)真菌毒素降解研究有一定的參考價值，為該酶在枯草芽孢桿菌中表達時，啟動子的選擇提供了一定的參考。

轉(zhuǎn)基因微生物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)品在食品工業(yè)中的安全性日益引起人們的關注。但常用的克隆和表達質(zhì)粒含有抗生素耐藥基因，需要在培養(yǎng)基中添加抗生素來維持質(zhì)粒穩(wěn)定性。雖然該方法在實驗室規(guī)模上可行，但由于高成本和生態(tài)限制，不適用于大規(guī)模的工業(yè)栽培。此外，即使在培養(yǎng)過程中添加了抗生素，質(zhì)粒仍可能不穩(wěn)定[37]。染色體整合表達是克服質(zhì)粒不穩(wěn)定性和表達系統(tǒng)中不安全因素的有效方法[20]，因此，為了更好地應用于食品和飼料生產(chǎn)，本試驗還探索了zlhy-6在枯草桿菌中的整合表達，其酶活性為0.4 U·mL-1，低于質(zhì)粒表達的酶活性。原因可能是拷貝數(shù)相對較低，可以通過構(gòu)造多拷貝表達載體來解決[38]?？莶菅挎邨U菌染色體整合表達的最關鍵步驟是通過2次交換將含有表達盒的P43-zlhy聚合物整合到枯草芽孢桿菌染色體的基因組中。在枯草桿菌中，amyE、lacA、gltA、pyrD、sacA、thrC等非必需基因已應用于基于同源重組的異位染色體整合[39]，最常用的是amyE基因座，因此，本試驗也選擇了這個位點。zlhy-6 在枯草桿菌中表達后，通過Cre/lox系統(tǒng)刪除抗生素抗性基因[26]，并通過該方法獲得了不含抗生素抗性基因表達玉米赤霉烯酮降解酶的重組枯草芽孢桿菌，該菌株可用于降解玉米、小麥等糧食在貯藏過程中霉菌產(chǎn)生的ZEN。同時，由于枯草芽孢桿菌本身在環(huán)境中具有很強的穩(wěn)定性，通過飼料造粒過程，其降解效率基本不降低，可知枯草芽孢桿菌能夠耐受動物胃腸道各節(jié)段的pH值[40-41]，并能夠直接應用于飼料中。本研究為在枯草芽孢桿菌中表達真菌毒素降解酶提供了參考，也為安全解決糧食儲藏和飼料生產(chǎn)中的ZEN污染提供了思路。

4 結(jié)論

本研究以全基因合成的方法獲得玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6，并在枯草芽孢桿菌中進行表達。利用含有雙啟動子表述載體的枯草芽孢桿菌表達玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6時，其表達量最高，對ZEN的降解效果最好。同時，為了克服質(zhì)粒表達的不穩(wěn)定性，去除抗生素抗性基因，本研究進行了枯草芽孢桿菌的整合表達，解決了蛋白表達過程中質(zhì)粒不穩(wěn)定現(xiàn)象。但是，與質(zhì)粒表達相比，表達量較低，有必要通過多拷貝表達、多整合位點表達等手段進一步提高表達量。