王麗娟, 李 慧, 李宏漫, 楊 平, 趙珂昕, 孫曉耀

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 糧食學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

枸杞多糖是枸杞中應(yīng)用價(jià)值最高的成分[1],具有促進(jìn)造血功能、降低血脂、防止脂肪肝形成、抑制腫瘤生長(zhǎng)、延緩衰老的生物學(xué)作用。目前,有關(guān)枸杞多糖抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等作用的研究均取得了一定的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),枸杞多糖可以增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能[2],通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞突變來(lái)提高機(jī)體的抗病能力[3]。近年來(lái)研究者相繼發(fā)現(xiàn)各種提取枸杞多糖的方法,例如酶解提取法、超臨界流體萃取法等。與熱水提取法相比,這些方法存在成本高昂、提取過(guò)程復(fù)雜等一定弊端[4]。水提法的優(yōu)點(diǎn)包括提取成本低、安全性高、操作簡(jiǎn)單,在水提過(guò)程中的料液比、提取溫度、浸提時(shí)間等因素都會(huì)影響枸杞多糖提取率[5]。因而,熱水浸提法仍是目前應(yīng)用較為廣泛的多糖提取法。本文探究了熱水提取方法對(duì)寧夏枸杞多糖的最佳提取工藝條件,可以為今后的多糖提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑的選用情況見(jiàn)表1,儀器與設(shè)備的選用情況見(jiàn)表2。

表1 材料與試劑Table 1 Materials and reagents

表2 儀器與設(shè)備Table 2 Instruments and equipment

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將寧夏枸杞洗凈并粉碎至200目過(guò)篩,加入無(wú)水乙醚(60～90 ℃),用無(wú)水乙醇浸提,然后將濾渣晾干,形成脫脂枸杞粉末。

1.2.2 枸杞粗多糖待測(cè)液的制備

稱取一定量預(yù)處理脫脂后的枸杞粉末,在料液比為20、浸提溫度90 ℃條件下放入水浴鍋中浸提5 h。浸提后的殘?jiān)俅斡猛瑯臃椒ㄖ貜?fù)提取、抽濾,并且將2次提取的濾液合并起來(lái),使用三氟乙酸法脫蛋白。將合并后的濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中調(diào)節(jié)溫度到60 ℃,進(jìn)行濃縮。向?yàn)V液中加入10% 的三氟乙酸溶液10 mL,搖勻后室溫下靜置12 h后離心,取上層清液,并添加蒸餾水定容至2 000 mL,得到枸杞粗多糖待測(cè)溶液。

1.2.3 枸杞粗多糖最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

準(zhǔn)備一個(gè)具塞試管,向其中加入2 mL枸杞粗多糖提取液,再加入2 mL蒸餾水,混勻后加入2 mL 6%的苯酚溶液并迅速加入濃硫酸10 mL,搖勻靜置1 h,然后利用分光光度計(jì)測(cè)定該提取液的OD值:在380～580 nm 處進(jìn)行掃描,最大吸收波長(zhǎng)即為得出最大OD值時(shí)的波長(zhǎng)[5]。

1.2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在試管中添加10%葡萄糖液,梯度為0.3,0.6,0.9,1.2,1.5,1.8,2.1和2.4 mL。再分別加蒸餾水定容至6 mL,加3 mL的6%苯酚溶液然后迅速加入10 mL的95%濃硫酸。在室溫下靜置1 h,用分光光度計(jì)測(cè)量其在最大吸收峰處的吸光度,繪出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

1.2.5 多糖含量的測(cè)定

稱取一定量的枸杞多糖待測(cè)樣品,用蒸餾水定容至100 mL,得到提取液,量取0.5 mL的提取液至50 mL容量瓶?jī)?nèi),定容并搖勻。精密量取1 mL定容后的液體,加入1 mL 5%苯酚溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)搖勻,緩慢滴加5 mL濃硫酸,搖勻后于70°水浴鍋上加熱30 min,取出冷卻至室溫。以水為空白在490 nm處測(cè)定吸光度,利用下面的公式計(jì)算樣品濃度[7]:

多糖含量(%)=由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的糖濃度(μg/mg)×樣品稀釋倍數(shù)÷測(cè)試樣品用量(mg)×103

1.3 枸杞多糖提取工藝的單因素試驗(yàn)

1.3.1 枸杞多糖提取時(shí)間對(duì)提取率影響的測(cè)定

稱取一定量脫脂后的枸杞粉末,提取溫度為100 ℃,料液比為1∶20,提取時(shí)間分別為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 h。測(cè)定多糖的含量時(shí)用苯酚-硫酸法,用比色法對(duì)比不同提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響[8]。

1.3.2 枸杞多糖料液比對(duì)提取率影響的測(cè)定

稱取一定量脫脂后的枸杞粉末,提取溫度為100 ℃,提取時(shí)間為1 h,料液比分別為1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30[9]。其余操作同1.3.1中操作。

1.3.3 枸杞多糖提取溫度對(duì)提取率影響的測(cè)定

準(zhǔn)備一個(gè)燒瓶,向其中添加一定量脫脂后的枸杞多糖粉末,在提取時(shí)間為5 h,料液比為1∶20的條件下提取一次,提取溫度分別為60,70,80,90,100 ℃,探究枸杞多糖提取率最高時(shí)的溫度[10]。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇料液比、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素,每個(gè)因素分別選取3個(gè)水平,進(jìn)行正交試驗(yàn),以確定枸杞多糖水浸提法的最佳條件。以正交表中最佳組合為優(yōu)化組、正交試驗(yàn)各因素最佳水平組為對(duì)照組,對(duì)最優(yōu)條件組合進(jìn)行驗(yàn)證[11]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 枸杞多糖最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

圖1為枸杞多糖的吸收曲率,枸杞多糖的吸光值從380 nm 處開(kāi)始逐步增加,峰值出現(xiàn)在490 nm處,之后吸光值隨著波長(zhǎng)的增加而下降,所以枸杞多糖的最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。

圖1 枸杞粗多糖的吸收曲率Fig.1 Absorption curve of Lyciumbarbarum polysaccharide

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲率Fig.2 Standard curvature of glucose

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖2可見(jiàn),葡萄糖溶液濃度在10～70 μg·mL-1,在波長(zhǎng)490 nm時(shí)線性關(guān)系良好,其回歸方程為

A=0.343 93C+0.011 21,R2=0.999 4(A:吸光度;C:葡萄糖溶液濃度)

2.3 枸杞多糖的單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)枸杞粗多糖提取率的影響

由圖3可知,提取時(shí)間在1～5 h時(shí),時(shí)間越長(zhǎng),枸杞多糖的提取率越高,并且上升速率非常快。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)5 h時(shí),提取率雖然也有增加,但是增加的速度很慢。所以繼續(xù)提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力,得不到更好的提取效果。最佳提取時(shí)間為5 h。

2.3.2 不同料液比對(duì)枸杞多糖提取率的影響

如圖4所示,料液比范圍在1∶10至1∶15之間時(shí),枸杞多糖提取率隨著料液比的增加而提高,且增長(zhǎng)速度快,在料液比為1∶15時(shí)枸杞多糖提取率達(dá)到峰值6.6%。當(dāng)料液比繼續(xù)增加后,枸杞多糖提取率呈下降趨勢(shì),原因可能在于料液比為15%時(shí),多糖浸出率基本飽和,在此條件下繼續(xù)增加料液比會(huì)導(dǎo)致成本增加但效果不顯著,所以料液比為1∶15是枸杞多糖最佳的提取料液比[13]。

圖3 不同時(shí)間下枸杞多糖提取率

圖4 不同料液比下對(duì)多糖提取率

2.3.3 粗多糖提取率與溫度的關(guān)系

圖5 溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on polysaccharide yield

由圖5可以看出,當(dāng)溫度在60～90 ℃時(shí),枸杞多糖提取率呈明顯增加趨勢(shì),90～100 ℃雖有提取率但增幅微小,原因可能為多糖屬于活性物質(zhì),溫度過(guò)高導(dǎo)致多糖的生物結(jié)構(gòu)被破壞進(jìn)而影響提取率,所以90 ℃為最佳提取溫度[12]。

2.3.4 最佳提取條件確定

根據(jù)R值大小可以看出各因素對(duì)枸杞多糖提取率影響大小順序?yàn)?提取時(shí)間>提取溫度>料液比;通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取效果具有極顯著性影響(P<0.01)，提取溫度對(duì)枸杞多糖提取效果具有顯著影響(P<0.05),正交試驗(yàn)得出最優(yōu)工藝組合為提取時(shí)間5 h,料液比1∶20,提取溫度100 ℃[13-14]。

表3 正交試驗(yàn)因素及試驗(yàn)結(jié)果表Table 3 Orthogonal test factors and test results

續(xù)表3

對(duì)正交試驗(yàn)最佳條件進(jìn)行了驗(yàn)證。在提取時(shí)間為5 h,料液比為1∶20,提取溫度為100 ℃條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得出結(jié)果見(jiàn)表4,說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果正確。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Orthogonal test factors and test results

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)提取溫度、料液比、提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),提取最佳的料液比為1∶15,提取最佳時(shí)間為5 h,提取率最高的提取溫度為100 ℃,但100 ℃的提取率較90 ℃的提取率僅增加0.08,原因可能是枸杞多糖屬于活性物質(zhì),溫度過(guò)高會(huì)破壞其內(nèi)部生物結(jié)構(gòu)導(dǎo)致多糖分解,所以提取率未能大幅度增加[16]。通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),枸杞多糖在提取溫度為100 ℃,料液比為1∶20,提取時(shí)間為5 h時(shí),具有最佳的提取工藝條件。由于不同因素之間存在交互作用,所以與單因素得出的結(jié)果有細(xì)微差異。本研究為今后多糖提取提供了參考,也有助于枸杞多糖在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。